[发明专利]牛X和Y精子特异miRNA标志物鉴定及其应用

说明书

本发明属于分子标记筛选技术领域，具体涉及牛X和Y精子特异miRNA标志物鉴定及其应用。提供了两个分别作为鉴别牛X和Y精子的miRNA生物标志物，即分子标记bta‑miR‑378和bta‑miR‑204，其中分子标记bta‑miR‑204的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；分子标记bta‑miR‑378的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明所提供的这两个miRNAs组成的miRNA生物标志物可用于牛X和Y精子的性别鉴定以及作为牛性别控制的分子标记的应用。

技术领域

本发明属于家畜繁殖技术领域，具体涉及牛X和Y精子特异miRNA标志物鉴定及其应用。所述的miRNA标志物包括bta-miR-204的核苷酸序列和bta-miR-378的核苷酸序列。上述序列可作为检测牛X和Y精子以及作为牛性别控制的分子标记。

背景技术

microRNA(微RNA，miRNA)是细胞内一类在进化上高度保守，长度约为22个核苷酸的非编码RNA的基因产物。miRNA来源于细胞内源性转录体，它以单链形式存在，通过与靶mRNA的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。

精子中含有种类丰富的RNA，其中最具特征是miRNA，在人精子中约占小RNA表达总量的7％(Krawetz et al.2011)。根据报道精子miRNA在精子成熟的不同阶段表达(Moazed2009)，在精子发生和生育过程中发挥着至关重要的作用。最近，有研究证明精子miRNA可以作为诊断和评估男性不育的潜在生物标志物(Abu-Halima et al.2014)。同时，在牛精子中，miRNA的表达量也与精子活力和质量及其相关(Capra et al.2017)，可用于作为诊断精液质量的标志物。由于X/Y精子所携带的性染色体不同，故两者精子成熟过程中转录和翻译可能存在一定差异表达miRNA，作为X和Y精子的特异标志物。

目前，在畜牧业中分离公牛X/Y精子主要采用流式细胞仪分选法，在奶牛生产中得到一定程度的应用。然而，该方法还存在需要专用设备以及存在降低分选精子活性和受胎率等缺点。如果能利用精子miRNA的调控基因及标识物的特性，开发出分选动物X/Y精子的新方法，或者基于基因调控的性别控制技术，从而控制动物后代的性别，对于提高家畜生产效率、经济效益和畜牧业可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种牛的X和Y精子特异miRNA标志物鉴定及其应用的小RNA进行了测序并进行系统的分析比较。本发明利用小RNA测序方法筛选可用于鉴别动物Y精子的miRNA标志物bta-miR-204和X精子miRNA标志物bta-miR-378，这两个miRNAs分别位于8号染色体47259591与47259612碱基间以及4号染色体10715305与10715326碱基间。本发明筛选的miRNA既可以作为分子标记，也可用于靶标精子的mRNA，干扰X或Y精子特定功能。

本发明的技术方案如下所述

申请人提供了一种用于牛X和Y精子鉴定的特异miRNA的分子标记bta-miR-204，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

申请人还提供了另一种用于牛X和Y精子特异miRNA的分子标记bta-miR-378，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明分子标记的筛选的具体方法为：首先对牛X和Y性别控制精子进行小RNA高通量测序，将所得的测序数据分别利用mirdeep2和Unitas两种miRNA注释软件进行分析，并将miRNA注释结果导入Deseq2软件进行X和Y精子差异表达miRNA分析，根据多重矫正后P值0.05(BH method)和log₂差异倍数2的阈值进行差异表达miRNA筛选，筛选出X精子和Y精子最显著差异表达的两个miRNA：即，bta-miR-204(P值＝0.04，log₂差异倍数＝-2.36)以及bta-miR-378(P值＝0.02，log₂差异倍数＝4.11)。