[发明专利]一种同步包装rAAV的方法

说明书

本发明提供了一种同步包装rAAV的方法，其包括以下步骤：对293T细胞进行扩大培养；采用多聚赖氨酸对培养容器进行处理，然后将三个质粒与PEI置于已经处理过的培养容器中进行混合，并于室温下静止作用，所述三个质粒包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒；消化293T细胞，得到293T细胞悬液；将293T细胞悬液加入到含有质粒的混合物中，然后进行培养；24小时后将旧液倾去，加入无血清DMEM；72小时收获并纯化浓缩。采用本发明的技术方案，无需提前24小时培养293T细胞，简化了实验步骤，缩短了时间，实现了快速包装，而且减少了血清使用量；该方法简单、易行且重复性高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同步包装rAAV的方法。

背景技术

随着现代分子生物学技术的发展，基因治疗是近年来诞生的新的生物医学治疗技术。其基本原理是，将外源基因即治疗基因通过载体系统导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为其遗传物质的一部分，以纠正或补偿基因缺陷或缺失引起的疾病，从而达到治疗目的。

整个过程中，基因治疗载体在基因治疗过程中起着至关重要的作用。目前常用的基因治疗载体主要包括病毒类和非病毒类两种。病毒类载体是当今基因工程研究的热点之一，主要包括取代型的重组病毒载体和重组的病毒质粒载体，包括逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)。rAAV(recombinant adeno-associated virus，重组腺相关病毒)是一种缺陷性病毒，不能独立复制增殖，只有在辅助病毒如腺病毒(Ad)、单纯疱疹病毒(HSV)等存在的条件下，才能在感染的宿主细胞中复制合成装配蛋白，产生新的病毒颗粒。在辅助病毒存在情况下，这一应答依赖于早期基因E1A、E1B、E4和E2A的表达。当无辅助病毒存在时，野生型AAV只能被定点整合到宿主细胞第19号染色体长臂上，形成潜伏性感染，病毒DNA随宿主细胞染色体的复制而复制，无AAV颗粒产生，至今尚未发现野生型AAV与任何人类疾病相关， AAV以其安全性好、宿主范围广、免疫原性低、携带外源基因可长期表达等优点而备受关注，广泛应用于人类和动物相关疾病的基因治疗。

目前，大多数生产rAAV的方法需要于包装前24小时将细胞铺于培养器皿上，包装6小时后补加含FBS的培养液，存在步骤多、耗时长和血清用量大等问题。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种同步包装rAAV的方法，能快速、简单地包装rAAV，而且能稳定在细胞中包装出带有目的基因的rAAV。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种同步包装rAAV的方法，其包括以下步骤：

步骤S1，对293T细胞进行扩大培养；

步骤S2，先采用多聚赖氨酸对培养容器进行处理，然后将三个质粒与PEI置于已经处理过的培养容器中进行混合，并于室温下静止作用；其中，所述三个质粒包括载体质粒、包装质粒和辅助质粒；优选的，所述多聚赖氨酸为多聚-L-赖氨酸；

步骤S3，消化293T细胞，得到293T细胞悬液；该步骤可以采用常规方法消化 293T细胞。

步骤S4，将293T细胞悬液加入到步骤S2得到的混合物中；

步骤S5，将培养容器放入37℃含5％CO₂培养箱内进行培养；

步骤S6，24小时后将旧液倾去，加入无血清DMEM；

步骤S7，72小时收获并纯化浓缩。