[发明专利]使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法

权利要求书

1.一种使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于：包括有以下步骤：

(1)采用异硫氰酸作为荧光素标记免抗人IgG和IgA抗体，作为二抗；

(2)采集人类精液，并分离精子和精浆；

(3)将步骤(2)分离的精子与步骤(1)的免抗人IgG和IgA于37℃下进行孵育，以直接特异性地与精子表面结合的抗精子抗体结合；

(4)随后加入碘化丙啶染色对精子进行染色，该碘化丙啶可以与死亡精子核特异性染色，活精子不染色；

(5)采用流式细胞仪检测精子，统计分析抗精子抗体阳性精子比率，精子表面结合抗精子抗体的相对密度，以及死亡或存活精子上结合型抗精子抗体的具体情况。

2.根据权利要求1所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于步骤(2)中还包括有：

a、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐的配置：

将0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，0.1g氯化镁，8.0g氯化钠，2.16g磷酸氢二钠和1.00gD-葡萄糖加入到750mL纯净水中，将0.132g氯化钙溶于10mL纯净水中，边搅拌边缓慢加入上述溶液中，用1mol/L NaOH调节pH至7.4，用纯净水定容至1000mL；

b、杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐-牛血清白蛋白的配制：

其中，缓冲液I的制备方法为：加0.3g牛血清白蛋白至步骤a中的100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；

缓冲液II的制备方法为：加5g牛血清白蛋白至100mL杜尔贝科Dulbecco的葡萄糖缓冲盐液中；并且所有溶液经0.45μm微孔滤器过滤，使用前温热至37℃。

3.根据权利要求2所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于步骤(2)中的精子的分离，包括有如下步骤：

①充分混匀精液标本，并吸取所需的精液量至离心管，并添加步骤b中的缓冲液I至10mL，并离心5～10分钟；

②弃去上清液，并加入10mL的缓冲液I重新悬浮精子，再次离心5～10分钟；

③用0.2mL缓冲液II轻轻地重新悬浮步骤②的精子液团，最后在显微镜下核查精子的浓度和活力。

4.根据权利要求3所述的使用荧光染料检测单个精子的抗精子抗体的方法，其特征在于在步骤(2)中的步骤c中的精子分成3组，包括空白对照检测管、抗精子抗体阳性精子管和抗精子抗体阴性精子管，并在每个精子管中加入步骤(1)中的免抗人IgG+IgA二抗溶液后加入5μL的碘化丙啶PI对精子进行染色，颠倒混匀。