[发明专利]一种快速检测镰刀菌DNA的方法

说明书

本发明涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为一条包含G‑四链体互补序列的核苷酸序列；S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互混合；S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；S4：引入硫黄素T，诱导产生G‑四链体结构，并与G‑四链体结合，产生荧光；检测和记录该荧光。本发明可将疑似含有镰刀菌DNA的小麦待测样品中的核酸信号转化为G‑四链体，在常温恒温下即可实现G‑四链体的不断扩增，将核酸的信号高度放大，通过硫黄素T结合G‑四链体产生稳定的荧光信号，从而实现高灵敏度的核酸快速定性分析测定。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速检测镰刀菌DNA的方法。

背景技术

镰刀菌是一类世界性分布的真菌，它不仅可以在土壤中越冬越夏，还可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)，引起植物的根腐、茎腐、茎基腐、花腐和穗腐等多种病害，寄主植物达100余种，侵染寄主植物维管束系统，破坏植物的输导组织维管束，并在生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，是生产上防治最艰难的重要病害之一。

目前，对于镰刀菌的检测的等温可视为检测，大多利用环介导等温扩增测定或者通过PCR法测定。

尽管恒温扩增技术以其恒温优势以及扩增效率高的特点得到广泛重视，但恒温扩增产物的检测未能突破荧光染料嵌入进行实时分析或凝胶电泳进行终点分析等传统的核酸扩增检测方法，真正意义上实现快速、简单、便携地检测核酸。

传统的荧光标记核酸扩增检测技术，需要进行荧光探针标记，操作繁琐，费时又昂贵并且其灵敏度不高。依托传统技术构建的荧光传感器虽然背景信号低，稳定性强，然而，由于实际样本成分复杂，靶标DNA含量极低，这就要求检测方法具有极高的灵敏度和特异性，常规的荧光标记核酸扩增检测技术的灵敏度和选择性无法满足其检测需求。

G-四链体(G-quadruplex)是由富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构。G-四链体(G-quartet)是四链体的结构单元，由Hoogsteen氢键连接4个G形成环状平面，两层或以上的四链体通过π-π堆积形成四链体。

硫黄素T(ThioflavinT，ThT)是一种水溶性荧光染料，自身荧光信号很低，但在单链、双链或三链DNA/RNA与G-四链体同时存在时，硫黄素T(ThioflavinT，ThT)能够区分不同的核酸类型，对G-四链体具有很强的结构选择性，与G-四链体结合并产生更加稳定的荧光。

发明内容

(一)要解决的技术问题

为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种G-四链体分子机器及核酸检测方法。G-四链体生成机器识别靶序列，并在靶序列的牵引之下扩大生成G-四链体，与硫磺素结合产生稳定的荧光，从而将靶序列信号扩大，达到定性的效果。无需荧光探针标记，灵敏度更高，操作更简单。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

一种快速检测镰刀菌DNA的方法，其包括以下步骤：

S1：提供特异性识别镰刀菌DNA的DNA分子机器，所述DNA分子机器为包括G-四链体互补序列的核苷酸序列；

S2：将所述DNA分子机器与待测样品相互识别；

S3：引入DNA聚合酶和切口酶，作用于DNA分子机器，发生DNA扩增反应；

S4：引入硫黄素T，诱导产生G-四链体结构，并与G-四链体结合，产生荧光；

S5：记录荧光发光情况。