[发明专利]一种高降解DNA测序文库的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种高降解DNA测序文库的构建方法及其应用，该构建方法是先将双链DNA 1变性，在得到的单链DNA 1的3′端连接单链接头，再用DNA聚合酶延伸连接单链接头的单链DNA 2使其成为双链DNA 2，然后向双链DNA 2无单链接头的一端连接标签T接头，成为双链DNA 3，最后用PCR扩增两端连接接头的双链DNA 3使其成为可测序文库。该方法极大的简化了基于ssDNA的NGS文库制备的过程，实现了低成本、高效率、高通量和低偏倚的高降解DNA测序文库构建，可用于高降解DNA片段测序分析。

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种高降解DNA测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

自下一代测序(next-generation sequencing,NGS)技术诞生以来，该技术成为一种重要的研究及检测、诊断技术，对生命科学、生物医学及医学的研究产生了深刻地影响。随着计算机运算能力的发展，NGS平台推动了过去几年生物学知识的爆炸式增长。与传统的Sanger测序法相比，NGS在测序前需要制备测序文库。NGS的测序过程已经高度自动化，而测序文库的制备是NGS测序的关键。

现有的标准建库流程主要步骤包括：DNA片段化(超声或酶切)、末端修平、加A、Y接头连接、片段选择及PCR扩增。标准建库流程为了提高接头连接步骤的效率，须对DNA片段进行多酶混合物处理的末端修平，使DNA片段的两端均成为平末端，以及必不可少的末端加A处理。虽然有不少公司推出了这些步骤的合并或优化方法，也推出了类似Y接头(如颈环接头)的接头连接等方法，但建库技术没有从根本上得到改变。此外，该种建库方法中，广泛采用了Y型接头，直到最后的PCR步骤才用带有Index的PCR引物进行不同DNA样品的区分，之后混合进行同一通道(lane)的测序。这种每个DNA样品单独经历整个建库建库流程才能混合测序的方法，极大地增大了操作的复杂性、试剂及人力消耗，不仅建库成本高，而且易于造成不同DNA样品在建库期间的人为偏差(bias)，不利于不同样品间的测序结果的平行比较。基于Y型接头的标准建库流程以及近年来出现的基于Tn5酶的片段化接头连接技术(tagmentation)，都比较适合分子量大的DNA的建库测序，如从各种细胞中提取的高分子量基因组DNA等。

高降解DNA常常是自然发生的降解程度较高的DNA，如常见的血液游离DNA、循环肿瘤DNA、循环胎儿DNA、古生物DNA、法医DNA、水体等环境游离DNA等。这类DNA由于脱离自然的细胞内环境，受到各种理化因素的作用而发生断裂，成为分子量小且分子内磷酸二酯键受损断裂的带有切刻(nick)的DNA分子，因此样品内分子具有多样性，包含了由于高度降解而在两条链中产生裂痕的超短(<100bp)双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)和常规dsDNA。运用Y型接头标准建库流程及Tn5片段化接头连接技术对这类DNA建库时，难以建立样品保真性高的DNA文库，导致带来很多DNA序列信息丢失。

为了解决这一问题，近年来逐渐发展了基于ssDNA的NGS文库构建方法。基于ssDNA的NGS文库构建方法在建库时，都首先将DNA样品变性解链，使其成为由各种长度ssDNA构成的DNA样品。ssDNA文库制备方法构建的文库中包含低于100bp的DNA片段，能够使原样品中的各种DNA分子有相同的机会进入文库被测序，因此提供更丰富的信息。然而，目前的基于ssDNA的方法通常涉及多个耗时且高成本低效率的步骤，包括起始DNA去磷酸化，通过生物素磁珠分离纯化，或通过特殊的酶(如CircLigase II)进行单链接头的连接。即使使用商品化的试剂盒，也需要特殊的逆转录病毒逆转录酶(DNA SMART ChIP-seq Kit，Clontech)。因此，基于ssDNA的NGS文库构建方法仍需发展新的技术。