[发明专利]一种微生物低温保存保护剂

说明书

本发明涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。微生物低温保存保护剂的成分为：非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水。本发明还建立了卡介菌低温长期保存的技术方法，为深入开展卡介菌的相关研究提供了技术支撑。

本申请为2016年12月7日提交的，发明名称为“一种微生物低温保存保护剂”的中国专利申请201611120538.1的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。

背景技术

冷冻干燥是一种常用的实现微生物长保质期的方法(CarcobaR，2000)，被广泛视为是最适合的细菌脱水过程之一，其目的在于获得稳定的最终试剂(Carvalho AS，2004)，也是用于贮存微生物细胞培养物的最常见方法之一。冷冻干燥后的细胞存活率反映了细胞抵抗快速冷冻和干燥的影响(Miyamoto-ShinoharaY，2008)。一般认为，大多数无保护的细菌在冷冻干燥后都会被杀死，而存活的那些在进行贮存时迅速死亡。要想获得理想的冷冻及冻干效果，除工艺外，筛选和使用适宜的冷冻保护剂也是十分重要的。适宜的冻干保护剂能够使微生物在冻干以及解冻的过程中降低死亡率，减轻冷冻干燥以及解冻时所引起的菌体损伤。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配置方法对微生物的保存效果有明显的影响。Harrison(1963)推荐冻干保护剂应具有以下条件：1)保护剂应含有能形成骨架的物质；2)它应含有限制剩余水分的缓冲物质；3)电解质的含量应少等。

已进行了多种尝试来增加冻干和贮存后存活的细菌的数量，但仅取得有限的成功。

选择适当的干燥介质/冷冻保护剂混合物是增加微生物尤其是细菌微生物在冻干和后续贮存过程中存活率的关键因素(Carvalho AS，2004)。现有技术中，CN101108164A报告了卡介菌多糖核酸在冻干中的几项研究。Castro等人评估了5％的海藻糖对保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)在冷冻干燥后存活率的有益效果，相比起在单独的水中的约1％的留存率，它们显示25％的留存率。2003年，Carvalho等人证明了谷氨酸钠对冻干和3-6个月的后续贮存期间的存活的稳定作用，但所报导的微生物存活率仍然很低。

卡介菌(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)源自具有致病性的牛型结核杆菌经230代次连续传代后形成的减毒菌株。我国目前涉及卡介菌的上市或临床研究中生物制品主要有皮内注射用卡介苗、卡介菌多糖核酸注射液(BCG-PSN)、卡介菌纯蛋白衍生物(BCG-PPD)、治疗用卡介苗、卡介菌CpG-DNA等。这些产品均涉及卡介菌活菌的收获与应用，因此现行版药典均对其种子批传代代次有要求，目的是降低细菌变异的风险。尤其对于活菌制品的菌种传代代次要求基本为：自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。然而国内卡介苗产品的代次多数为12代，国外卡介苗制品的代次则多为3-5代，这种差别的主要原因是菌种首次复苏后活菌量少，只能通过增加培养代次来满足生产需要。解决该问题的首要关键之一是如何提高卡介菌菌种首次复苏的活菌含量。正常情况下，接种的活菌含量越多，菌种复苏所需的时间越短，形成的菌苔或菌膜的质量越高，反之，活菌含量越低，所需要的复苏时间就越长，进一步影响后续的传代与收获。卡介苗菌种所含的活菌数量与菌种的保存形式有关。菌种的保存形式有两种，一种为冻干保存，一种为液体冷冻保存。冻干菌种为卡介菌培养物加冻干保护剂后经过低温冷冻真空干燥制备而成，冻干后活菌较稳定，可在2-8℃保藏与运输，在室温下也能保持相对稳定；但冻干后菌种活菌含量下降，平均仅为冻干前液体菌种的16％-20％左右，且菌株经干燥后复苏时间也较长。菌种的另一种保存方式为液体冷冻保存菌种，即卡介菌新鲜培养物加低温保存保护剂后，在-20℃及以下温度冷藏，该方式具有保持活菌含量高容易复苏的特点。

目前，现有技术中对卡介菌的研究中，多针对卡介菌多糖核酸的保存进行研究，而对卡介菌活菌的菌种保存研究较少，同时，在菌种的保存中，基本都是采用冻干保存，存在冻干菌种复苏慢、保存效率不高等问题。