[发明专利]一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法

说明书

本发明提供一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε‑聚赖氨酸的发酵方法。以丝瓜络或海绵作为细胞固定载体，安装固定于发酵罐内搅拌子、轴及档板，随后加入发酵培养基，灭菌冷却后接入液体种子。发酵过程细胞吸附至固定化载体，实现细胞固定化；在ε‑聚赖氨酸合成阶段间歇流加灭过菌的有机氮源溶液；当发酵液中ε‑聚赖氨酸积累至3.0 g/L时，采用离子交换树脂离位分离ε‑聚赖氨酸，当发酵液重新积累至3.0 g/L时重复分离过程。本发明采用细胞固定化和离位分离技术相结合用于ε‑聚赖氨酸发酵，并结合有机氮源间歇流加，可有效促进细胞生长、产物合成以及延长合成期，显著提高ε‑聚赖氨酸发酵产量，具有实际应用推广前景。

技术领域

本发明属于生物工程应用领域，涉及一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法。

背景技术

ε-聚赖氨酸是链霉菌合成的一种胞外L-赖氨酸多聚合物，其赖氨酸残基通过α-羧基与ε-氨基脱水缩合连接，为一种异型肽，分子量通常为3500-4000。ε-聚赖氨酸抑菌谱极广，对细菌、酵母菌、霉菌以及病毒均具有抑菌活性，且抑菌浓度低。抑菌机理为带正电的ε-聚赖氨酸经静电作用吸附至带负电荷的微生物细胞表面，破坏细胞质膜和致使胞内物质泄漏，起到抑制或杀灭微生物的作用。此外ε-聚赖氨酸还具有耐热、水溶性好、可食用、可生物降解、无毒等优点，因此，ε-聚赖氨酸是一种理想的高安全性天然食品防腐剂。

当前食品工业主要使用化学合成类防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾、丙酸钙、亚硝酸盐等，但这些化学合成类防腐剂对人体具有潜在危害，因此，天然来源的防腐剂由于其高安全性受到人们的亲睐，其代替化学合成类防腐剂用于食品防腐保鲜成为今后的必然趋势。ε-聚赖氨酸作为一种微生物源的食品防腐剂已在日本、韩国、美国等国家得到广泛应用。2014年，我国批准ε-聚赖氨酸可作为一种食品防腐剂添加至食品中以防腐和保鲜，因此，ε-聚赖氨酸在我国食品工业中的需求将不断增长，市场需求大。

目前，ε-聚赖氨酸主要通过微生物发酵法进行生产，也是迄今为止惟一具有经济性的生产方法，在日本已采用该法进行商业化生产。报道显示ε-聚赖氨酸发酵大多主要采用自由细胞，但这不利于提高发酵液中的细胞浓度，是ε-聚赖氨酸低发酵产量的一个重要因素；另外，ε-聚赖氨酸作为一种次级代谢产物，发酵过程中ε-聚赖氨酸积累至一定水平后其抑制细胞的进一步合成，不利于提高ε-聚赖氨酸产率，因此，ε-聚赖氨酸发酵方法开发中须克服上述2种显著不利因素，将进一步提高ε-聚赖氨酸发酵产量。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用细胞固定化和离位、间歇吸附分离ε-聚赖氨酸的发酵方法，能够获得极高的ε-聚赖氨酸产量，且发酵结束时也完成了产物回收。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

（1）以丝瓜络或海绵（切割为长宽厚约20 cm×10cm×1.5cm，或其它规格，视发酵罐大小而定）为固定化载体，先将其安装固定于发酵罐搅拌子、轴以及档板；随后将发酵培养基（配方为葡萄糖50 g/L；酵母粉5 g/L；(NH₄)₂SO₄ 10 g/L； KH₂PO₄ 1.36；K₂HPO₄ 0.8 g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L；ZnSO₄·7H₂O 0.04 g/L；FeSO₄·7H₂O 0.03 g/L）加入发酵罐内，121℃灭菌30 min，冷却至约30℃时用12.5%氨水将培养基起始pH调至6.8。

（2）按接种量 5% (v/v)将ε-聚赖氨酸产生菌（一种链霉菌）液体种子接入发酵罐，发酵条件为搅拌子不工作即转速为0，温度30℃，通气量1.0 vvm。

（3）发酵过程产生菌细胞吸附并生长于固定化载体，发酵液中游离细胞极少。