[发明专利]荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针，引物和探针中设计有是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的碱基。本发明试剂盒相对于PCR毛细管电泳方法，荧光定量PCR方法针对FMR1甲基化进行检测，不受(CGG)n重复数次数过多的限制，因此不容易造成漏诊；而相对于MS‑PCR，荧光定量PCR方法除了引物上带有针对甲基化位点检测的特异性，还在探针上也增加了对甲基化位点检测的特异性。

技术领域

本发明涉及分子诊断领域，特别涉及荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒及其应用。

背景技术

脆性X综合征(Fragile X Syndrome,FXS)是仅次于唐氏综合征的发病率第二高的遗传性智力低下疾病，为不完全显性X连锁遗传病。脆性X综合征智力低下基因I(Fragile XMental Retardation I,FMR1)位于染色体Xq27.3，在基因组序列约38Kb，由17个外显子和16个内含子组成。FXS的分子遗传学基础是FMR1基因5'端非编码区(CGG)n的数目不同，分为正常、前突变、全突变。(CGG)n重复序列的长短在人群中具有多态性。在FXS患者中，(CGG)n重复超过230次，甚至可达上千次，这种类型称为全突变。全突变经常伴随(CGG)n重复区和FMR1基因启动子区域的高度甲基化。另一种情况为FXS患者从其母亲处继承了异常的FRM1等位基因，他们的母亲或者携带了相似的异常重复，但由于女性X染色体的随机失活而没有表现异常表型，或者其FMR1等位仅是过渡形式，称为前突变。前突变的(CGG)n重复数为53-230个之间，小的前突变没有异常甲基化；大的前突变会出现部分甲基化。

FXS临床表型包括智力低下、注意力障碍、有自闭症倾向。青春期后典型患者还具有高前额、大耳和下颌突出、大睾丸、关节活动度过大等体格特征。由于在青春期前患病儿童的临床表现无特异性，所以疾病诊断和筛查主要依据实验室诊断方法。目前常用的分子诊断方法有PCR毛细管电泳法，甲基化特异PCR方法(MS-PCR)。PCR毛细管电泳法是针对FMR1基因的(CGG)n重复区域设计合适的引物，扩增该重复区域，扩增片段大小将由(CGG)n重复次数决定，通过毛细管电泳区分PCR产物的大小，根据该大小推算出(CGG)n重复数。PCR毛细管电泳方法的优点是对于正常和小的前突变尤其有效。但大的全突变扩增就困难，可能导致漏诊。

MS-PCR方法是针对FMR1基因的全突变和大的前突变会引发FMR1基因的启动子区发生甲基化的情形来实现诊断的。但MS-PCR最终需要通过电泳方式来检测是否存在甲基化，难以做大量样本的筛查。并且MS-PCR中只单靠PCR引物的特异性来区分甲基化和非甲基化状态的DNA，特异性并不好。

发明内容

本发明提供一种荧光定量方法检测FMR1基因启动子区域甲基化的试剂盒，所述试剂盒包括检测FMR1基因启动子区域甲基化的以下PCR引物和探针：上游引物：下游引物：和探针序列：其中斜粗体字的碱基是针对FMR1基因甲基化位点进行设计的碱基。

在一种实施方式中，所述探针序列的5’端带有荧光报告基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。

在一种实施方式中，所述扩增内参基因为人Actb基因基因；Actb基因上游引物：GTGTATAGGAGAGTATTAGGAAGTGGT，Actb基因下游引物：CCACTAAACCTCCATTCAACTAACC；和Actb基因探针的序列为：AAAACAAAAACTCCAACCCCACCC。

在一种实施方式中，所述Actb基因探针5’端带有荧光发光基团VIC，3’端带有荧光淬灭基团MGB。

在一种实施方式中，提供上述试剂盒在脆性X综合征检测中的应用。