[发明专利]一种在鱼类中实现基因组编辑、精确定点基因敲入的方法

说明书

本发明提供了一种在鱼类中实现精确定点基因敲入的方法，利用基于切口酶产生DNA单链缺口的技术，辅以一套同源重组修复因子RecOFAR来实现高效、精确、定点的鱼类基因组编辑、基因敲入整合。克服了目前已有方法效率偏低、靶位点随机突变频率较高等等问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在鱼类中实现精确基因组编辑、定点基因敲入的方法。

背景技术

随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科学的研究进入后基因组时代。在后基因组时代，基因组研究的重心将转向基因功能，即由测定基因的DNA 序列、解释生命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类健康和疾病的奥秘(Peltonen and McKusick, 2001)。科研人员们已经开始通过各种尝试，想要将基因组研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗（personalized medicine）工作当中(Chan and Ginsburg, 2011)。不过面对海量枯燥的基因组信息，科研人员们该如何将这些数据转换成有意义的基因组功能，解决这个问题的一个关键在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型（genotype）对表型(phenotype）的影响作用。

利用同源重组机制（homologous recombination）对基因进行定向失活（Targetedgene inactivation）就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因的功能(Capecchi,2005)。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。而 RNA 干扰技术（RNA interference，RNAi）等基因靶向敲除技术则为科学家们提供了一种快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法(Hannon, 2002; McManus and Sharp, 2002)。不过RNAi 这种基因敲除技术的敲除效果还不够彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都会有差异，另外还存在不可预知的脱靶情况（off-target effect），所以只能够用于需要暂时抑制基因功能的试验当中(Jacksonet al., 2003; Jackson andLinsley, 2004)。

近十年来出现了一种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术（genomeediting）”，比如锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases,ZFN）、转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases, TALEN）、基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和Cas 蛋白的DNA 核酸内切酶（clustered regulatory interspacedshort palindromic repeat (CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）等介导的基因编辑技术(Gaj et al., 2013)。这些核酸酶能够对基因组进行人工修饰，其基本原理是在靶位点区诱发DNA 双链缺口（double-strand breaks, DSBs），然后启动非同源区的末端连接（NHEJ）DSB 修复机制产生突变(Barnes, 2001; Lieber, 2010)或是利用同源重组（HR）修复机制(van den Bosch et al., 2002)完成我们所需要的各种人工修饰。