[发明专利]一种液相芯片技术检测微生物的方法

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的液相芯片技术检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，根据布鲁氏菌、沙门氏菌、狂犬病毒、弓形虫、巴氏通体和弯曲杆菌的基因序列分别设计合成对应的5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的布鲁氏菌探针、5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的沙门氏菌探针、5’端修饰有氨基的SEQ IDNO.3所示的核苷酸序列的狂犬病毒探针、5’端修饰有氨基的SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列的弓形虫探针、5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的巴氏通体探针和5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列的弯曲杆菌探针；

S2，将布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针分别与第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球相连，分别获得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液；

S3，将布鲁氏菌、沙门氏菌、狂犬病毒、弓形虫、巴氏通体和弯曲杆菌阴性样品，经DNA抽提和PCR扩增获得阴性PCR产物，将第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液混合形成混合偶联微球的探针溶液，然后将阴性PCR产物加入混合偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，根据该信号得阈值；

S4，将待测物样品，经DNA抽提和PCR扩增获得布鲁氏菌、沙门氏菌、狂犬病毒、弓形虫、巴氏通体和弯曲杆菌的待测PCR产物，将待测PCR产物加入混合偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，与阈值比较，判断待测物样品为阴性或阳性；

获得待测PCR产物具体方法包括如下步骤：

P1，在布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针的上下游分别设计上下游引物，获得布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物；

P2，利用布鲁氏菌引物、沙门氏菌引物、狂犬病毒引物、弓形虫引物、巴氏通体引物和弯曲杆菌引物扩增，分别获得布鲁氏菌目的基因BL、沙门氏菌目的基因SM、狂犬病毒目的基因WQ、弓形虫目的基因GX、巴氏通体目的基因BA和弯曲杆菌目的基因KQ及包含布鲁氏菌目的基因BL、沙门氏菌目的基因SM、狂犬病毒目的基因WQ、弓形虫目的基因GX、巴氏通体目的基因BA和弯曲杆菌目的基因KQ的多重PCR产物；

所述布鲁氏菌引物包括5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的布鲁氏菌上游引物和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的布鲁氏菌下游引物；

所述沙门氏菌引物，包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的沙门氏菌上游引物和5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的沙门氏菌下游引物；

所述狂犬病毒引物，包括5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的狂犬病毒上游引物和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的狂犬病毒下游引物；

所述弓形虫引物，包括5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列的弓形虫上游引物和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的弓形虫下游引物；

所述巴氏通体引物，包括5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的巴氏通体上游引物和SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列的巴氏通体下游引物；

所述弯曲杆菌引物，包括5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的弯曲杆菌上游引物和SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的弯曲杆菌下游引物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针的Tm值保持在56℃-58℃。

3.一种液相芯片技术检测微生物的探针和引物组，其特征在于，所述探针为：5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的布鲁氏菌探针、5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的沙门氏菌探针、5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的狂犬病毒探针、5’端修饰有氨基的SEQ IDNO.4所示的核苷酸序列的弓形虫探针、5’端修饰有氨基的SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的巴氏通体探针和5’端修饰有氨基的SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列的弯曲杆菌探针；

所述引物为：5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的布鲁氏菌上游引物和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列的布鲁氏菌下游引物；SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列的沙门氏菌上游引物和5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的沙门氏菌下游引物； 5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的狂犬病毒上游引物和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列的狂犬病毒下游引物； 5’端修饰有生物素的SEQ IDNO.13所示的核苷酸序列的弓形虫上游引物和SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列的弓形虫下游引物；5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.15所示的核苷酸序列的巴氏通体上游引物和SEQID NO.16所示的核苷酸序列的巴氏通体下游引物； 5’端修饰有生物素的SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列的弯曲杆菌上游引物和SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列的弯曲杆菌下游引物。