[发明专利]基于数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及其试剂盒与方法

说明书

本发明公开了一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及其试剂盒与方法。引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe；检测试剂盒包括2×ddPCR Supermix、无RNA酶的超纯水、细菌总DNA提取试剂、阴性对照和阳性对照。其检测方法是通过提取待检样品DNA，利用微滴数字PCR技术对待检样品DNA进行定量检测，通过扩增分析得到的拷贝数判断待检样品是否含有猪链球菌，并测定其含量。本发明具有精准、灵敏、适用性广，无需依赖标准曲线，可实现绝对定量等优点，可实现猪链球菌病诊断的早发现、早治疗和早预防，能有效控制疫情爆发。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针及其试剂盒与方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是猪群中一种常见的条件致病菌，其通常在猪的上呼吸道(尤其是扁桃体和鼻腔)、生殖道或消化道内定居，在严重时感染猪会出现脑膜炎、败血症、肺炎及关节炎等病症，可导致青年猪猝死。根据链球菌菌体荚膜抗原特性的不同，猪链球菌可以分为35个血清型(1～34型和1/2 型)，其中1，2，7，9型是猪的致病菌。并且还能引起人类感染，感染后也会出现脑膜炎、败血症、肺炎、关节炎、心内膜炎、腹膜炎及眼内炎等严重病症，甚至会引起死亡，严重威胁到人类健康和公共卫生。1968年丹麦首次报道人感染猪链球菌，随后南亚、北欧等国家和地区也相继出现了人感染猪链球菌的报道。距今为止，该病已报道超过700例，全球范围内几乎所有养猪国家和地区均有猪链球菌病的报道，其中主要分布在亚洲地区。根据《中华人民共和国动物防疫法》及其相关规定，猪链球菌病为二类动物防疫病。该病的传播对我国食品安全、畜牧业生产安全以及相关从业人员也带来巨大的威胁。因此，加强对猪链球菌检测技术的研究，开展猪链球菌的检测，防止猪链球菌的传入传出，对进出口贸易的技术保障具有重要意义。

目前，实验室常用的检测猪链球菌的方法有细菌分离、血清学诊断技术(凝集反应和酶联免疫吸附试验等)和分子生物学检测技术(常规PCR，实时荧光定量PCR和环介导等温扩增技术等)。传统的细菌分离和血清学检测方法，存在耗时长、对检测人员技术要求高、操作复杂以及敏感性差等诸多不足。PCR 操作复杂，需进行跑胶分析，并且灵敏度低；实时荧光PCR需使用昂贵的仪器设备并依赖标准曲线进行定量检测，灵敏度仍存在一定的局限性；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。

数字PCR(digital PCR，dPCR)是近十年来兴起的第三代PCR技术，其原理是将预混的PCR反应体系进行微滴化处理，形成几万至几十万个油包水的液化微滴中，保证每个微滴中含有一个或不含有核酸模板，经过PCR扩增后，经过荧光检测每个微滴中的阳性微滴数和阴性微滴数，根据泊松分布原理即可计算出核酸模板的初始拷贝数。与实时荧光PCR相比，该方法具有精准、灵敏度超高和不易受PCR抑制物影响等优点。而现有技术并没有利用数字PCR技术针对猪链球菌进行绝对定量检测的相关研究以及是否可行的相关方案及适合产业化的成品试剂盒。因此，开发相关利用数字PCR技术对猪链球菌进行检测的方法和试剂是业界亟待解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种基于数字PCR技术检测猪链球菌的引物和探针，包括上游引物FP、下游引物BP、探针Probe，其核苷酸序列分别如下所示：

FP：5’-GGCGGTCTTCGCTTCCA-3’(SEQ ID NO：1)；