[发明专利]一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法

说明书

一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，其特征在于，活化白念珠菌并孵育流动态白念珠菌生物被膜，利用离子交换树脂提取生物被膜胞外基质，用UPLC‑TOF‑MS鉴别被膜胞外基质中除蛋白质以外的成分。本发明的样本的前处理过程去除蛋白质成分彻底，从而使得蛋白质外组分的检测效果好。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法。

背景技术

白念珠菌是一种腐物寄生菌，平时生存于人体的皮肤、粘膜、消化道及其他脏器中，当机体抵抗力降低时，白色念珠菌就会繁殖，达到一定量时，人体就会发病，因而，白念珠菌是一种人类条件致病性真菌。

白念珠菌可以通过形成生物被膜提高自身的耐药性。白念珠菌生物被膜分泌的胞外基质成分非常复杂，总体来说含有蛋白质(占胞外基质干重55％)、多糖(占胞外基质干重25％)、脂质(占胞外基质干重15％)及核酸(占胞外基质干重5％)等大分子物质。

发明内容

本发明目的在于提供一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一种白念珠菌生物被膜胞外基质蛋白质外组分的检测方法，包括下列步骤：

第一步：白念珠菌活化

将白念珠菌接种于SDB培养基中，摇床孵育20～28h；培养液离心后收集真菌细胞，用无菌PBS缓冲液清洗，然后将清洗所得真菌细胞重悬于RPMI-1640培养基中，再孵育12-18h，然后在4℃条件下，以2500～3500转/min离心，收集下沉的真菌细胞，添加真菌培养基调整真菌细胞浓度到0.8～1.2×10⁶CFU/ml，得到重悬菌液；

第二步：流动态白念珠菌生物被膜孵育

将医用导管片在乙醇中浸泡以保持无菌，用无菌水清洗后，再将其加入到所述重悬菌液中，在摇床中孵育，使白念珠菌粘附于所述医用导管片上，然后对粘附在医用导管片上的白念珠菌进行流动孵育，结束后孵育得到形成有成熟生物被膜的白念珠菌；

第三步：将形成有成熟生物被膜的白念珠菌加入pH值为7.8的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄离子缓冲液中，先涡旋震荡，然后再超声处理得到悬浮液，将经过预处理的强酸性阳离子交换树脂与悬浮液混合，摇床孵育2～4h，接着用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，以7500～8500rpm/min离心2～4min，得到上清液。

优选的技术方案为：每升SDB培养基含有10g蛋白胨，20g琼脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。

优选的技术方案为：所述RPMI-1640培养基的原料配方包含下列质量百分比的原料：1％的甘露醇、1％的营养肉汤、0.2％的K₂HPO₄和1.35％的琼脂粉。

优选的技术方案为：每升所述真菌培养基含有400mg的氯化钾、6000mg的氯化钠、2000mg的葡萄糖、290.00mg的L-精氨酸、50mg的L-天冬酰胺、20mg的L-天冬氨酸、65.15mg的L-胱氨酸二盐酸盐、20mg的L-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的L-组氨酸、20mg的L-羟脯氨酸、50mg的L-异亮氨酸、50mg的L-亮氨酸、40mg的L-赖氨酸、15mg的L-甲硫氨酸、15mg的L-苯丙氨酸、20mg的L-脯氨酸、30mg的L-丝氨酸、20mg的L-苏氨酸、5mg的L-色氨酸、23.19mg的L-酪氨酸、20mg的L-缬氨酸，100ml的质量浓度为10％的胎牛血清，其余为纯化水，然后用3-(N-玛琳代)丙磺酸调整pH值至7.0。