[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应等温检测试剂及检测方法

说明书

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋扩增等温检测方法(Reverse transcription polymerase spiral reaction，RT‑PSR)。本发明提供了一套完整的猪流行性腹泻病毒聚合酶螺旋检测方法，包括检测试剂和反应条件，根据基因保守区设计合成一对特异性引物，包括上游引物S3、下游引物S4，检测试剂包括如下组分：10×Bst Buffer反应缓冲液、dNTPs、MgSO₄、Bst DNA聚合酶、AMV反转录酶、DEPC水、显色试剂和上述引物。本发明提供的检测方法在应用时具有特异性强、灵敏性高、操作简便、成本低廉等优点。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒的反转录聚合酶螺旋反应(reverse transcription polymerase spiral reaction，RT-PSR)等温检测试剂及检测方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的，病毒粒子呈圆形或椭圆形，属于冠状病毒科，表面有囊膜，囊膜上有放射状纤突，囊膜内为核衣壳蛋白与RNA形成的蜷曲缠绕状结构。PEDV能够引起各个年龄阶段的猪感染，临床症状与传染性和胃肠炎病毒(TGEV)引起的症状类似，主要包括腹泻、呕吐、严实4、脱水及体重减轻等，仔猪的临床症状较为严重，出现大量的死亡，死亡率最高可达100％，给养猪业带来巨大的经济损失。

PEDV的爆发首先在英国被报道，CV777毒株在比利时被分离发现，1978年被认为是造成比利时爆发PED的元凶，证实了区别于TGEV的存在，在1982年，被证实命名为PEDV，此后的40年里，PEDV在欧洲、亚洲、美洲等众多养猪国家相继爆发，并造成相当大的经济损失。在亚洲，我国在1973年就有关于PED的报道，描述了类似于临床症状的一种疾病，但直到1984年引起这种疾病的病原才被分离发现。2010年之前，尽管PED在我国时有发生，但呈现散发性和区域性特点。2010年我国南部省份爆发了高致病的PED，并迅速蔓延至全国，仔猪的死亡率高达100％。在日本，首先检测到PED是在1982年，且在2013年，高致病性PED在日本爆发。1992年，在韩国报道出现PED，2004-2013年PED在韩国得到控制，未出现大范围的爆发。但在2013年，韩国出现了高致病性毒株的爆发。在亚洲其他地区如：泰国、菲律宾等也有PED的相关报道，且在2013年前后相继爆发高致病性PED。

PED的流行通常表现为对新生哺乳仔猪易感，且造成严重的后果，同时，PED还与其他致病源共感染，例如：大肠杆菌感染、猪圆环病毒2型TGEV和轮状病毒。新生仔猪体重减轻、水样腹泻、呕吐、脱水、高死亡率，粪便呈黄白色有酸臭味是PED的典型症状。组织学病变包括急性、弥漫性、严重的萎缩性肠炎，浅表上皮细胞的轻度空泡化及结肠、盲肠的上皮水肿；急性感染期间，在空肠的绒毛尖端或整个绒毛上观察到空泡化的细胞或大块细胞剥落，萎缩的绒毛通常与退化或再生的扁平上皮融合及覆盖在上面，在固有层细胞中有明显的炎性细胞浸润。PEDV感染的的早期(即潜伏期)感染猪表现出正常的绒毛长度，但空泡状细胞坏死已经开始出现；腹泻发生后的1-3天，受感染的猪表现出严重的绒毛缩短；感染后期(临床症状出现后84-120h)持续的细胞坏死导致中度到重度的绒毛萎缩。