[发明专利]工程化异体和免疫抑制耐受性T细胞的方法

权利要求书

1.一种工程化用于免疫疗法的离体细胞的方法，包括以下的基因改变步骤：

(a)将至少一种稀切内切核酸酶引入至所述细胞，以使所述稀切内切核酸酶特异性地催化所述细胞的基因组的一种靶标序列断裂；

(b)将外源核酸引入至所述细胞，所述外源核酸连续包括与所述断裂的上游序列同源的第一区域、将要插入所述细胞的基因组中的序列以及与所述断裂的下游序列同源的第二区域；

其中，引入的所述外源核酸灭活选自由TCRα、TCRβ、CD52和GR组成的组中的基因并且整合至少一种编码至少一种感兴趣的重组蛋白的外源多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，感兴趣的所述蛋白是pTα或其功能变体、嵌合抗原受体(CAR)、多链CAR、双特异性抗体或者靶向PDCD1或CTLA-4的稀切内切核酸酶。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述外源重组多核苷酸编码用于具体细胞识别的CAR。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述CAR抗CD19抗原。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述CAR包括与SEQ ID NO:73具有至少70％同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括初级细胞。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述细胞是T细胞，所述T细胞从供体或从初级细胞的培养物可获得，或者所述T细胞来源于干细胞，如诱导多能干细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括在体内扩增所述T细胞的步骤。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶识别和断裂由以下组成的组中的靶标序列：

-SEQ ID NO:1至6(GR)，

-SEQ ID NO:37、57至60(TCRα)，

-SEQ ID NO:38或39(TCRβ)，和

-SEQ ID NO:40、61至65(CD52)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中，所述稀切内切核酸酶是TALE-核酸酶。

11.一种分离的细胞或细胞系，由根据权利要求1至10中任一项所述的方法可获得。

12.根据权利要求11所述的分离的细胞，其中，选自由以下各项组成的组中的两种基因已灭活：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ。

13.根据权利要求11或12所述的分离的细胞，其中，所述细胞是通过灭活参与免疫检测点如PDCD1和/或CTLA-4的至少一种蛋白质而进一步基因改变的T细胞。

14.根据权利要求11-13中任一项所述的分离的细胞，用于作为药物使用。

15.根据权利要求11-13中任一项所述的分离的细胞，用于在治疗诊断患有癌症、病毒感染、自身免疫失调或移植物抗宿主疾病(GvHD)的患者中使用。

16.根据权利要求11-13中任一项所述的分离的细胞，用于在治疗白血病和淋巴瘤中使用。

17.一种药物组合物，包括根据权利要求11-16中任一项所述的分离的细胞。