[发明专利]一种在中华仓鼠卵巢细胞中表达生产类人润滑素的方法

权利要求书

1.一种表达生产重组类人润滑素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将来源于人的编码类人润滑素的基因连接到表达载体pCHO1.0，转化CHO细胞株，经筛选得到分泌表达重组类人润滑素的工程细胞株，

2）一级种子培养，

3）二级种子培养，

4）连续流加培养，

5）收集培养上清，纯化重组类人润滑素；所述重组类人润滑素的氨基酸序列如 SEQ IDNO.1所示；

步骤4）是用基础培养基将二级种子细胞按（0.6±0.1）×10⁶个/ml的接种密度稀释至3L 细胞培养反应器中，初始培养体积为1 L；设置搅拌转速为200~250 r/min；pH设置为6.8~7.2，关联碳酸氢钠溶液和CO₂以调节pH；溶解氧设置为20~60%；1~4天的培养温度设置为36.5±0.5℃；培养第5天降温至32~34℃；培养至第14天，停止培养、收获目的物；

其中，在步骤4）的培养的第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补加补料培养基A、补料培养基B、酪氨酸和酵母水解物，补料培养基A的补料体积为初始培养体积的4%，补料培养基B的补料体积为初始培养体积的0.4%，酪氨酸的添加量为5 g/L，酵母水解物的添加量为16 g/L；补料培养基A为：Cell Boost 7a 170.0 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 20.5 g/L；补料培养基B为：Cell Boost 7b 90.1 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 179 g/L；

基础培养基为：ActiCHO Pro 22.2 g/L，5 mmol/L氢氧化钠 7.56 g/L，碳酸氢钠 1.79g/L，聚糖硫酸酯钠盐0.05 g/L；

在步骤4）的培养过程中，葡萄糖浓度低于3.0 g/L时，添加葡萄糖浓缩液提高细胞培养液的葡萄糖浓度至5.0 g/L。

2.根据权利要求1所述的一种表达生产重组类人润滑素的方法，其特征在于，步骤5）是将培养液进行澄清过滤后，去除多聚核苷酸；然后，用GE Q Big Beads^TM阴离子交换柱进行亲和纯化。