[发明专利]一种生产重组血小板源生长因子的方法

权利要求书

1.一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，将来源于人的rhPDGF-BB基因置于表达载体pCHO1.0中，转化CHO细胞株，获得分泌表达rhPDGF-BB的工程细胞株，培养该工程细胞株使之生产重组血小板源生长因子，包括以下步骤：

1)一级种子培养，

2)二级种子培养，

3)反应器连续流加培养，用基础培养基将二级种子细胞按1.0×10⁶个/ml的接种密度稀释至2L细胞培养反应器中，得到1L的二级种子细胞与基础培养基混合物；搅拌转速设置为280r/min；pH设置为6.95±0.15，pH值通过碳酸氢钠溶液和CO₂进行调节；溶解氧设置为40±20％，氧气气体流量为1.5～400ml/min，根据溶氧消耗情况调整氧气气体流量；1～4天培养温度设置为36.5±0.5℃，第5天降温至33.5±0.5℃，发酵14天结束；连续流加培养过程中，第3、5、7、9、11天用补料培养基进行补料，补料体积为40mL；当葡萄糖浓度低于2.0g/L时，补加葡萄糖浓缩液使葡萄糖浓度增至4.0g/L；

步骤1)一级种子培养，是用预热至36.5±0.5℃的种子培养基将细胞按0.5±0.1×10⁶个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增培养，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO₂，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增3次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×10⁶个/ml；

步骤2)二级种子的制备，是用预热至36.5±0.5℃的基础培养基将一级种子细胞按0.5±0.1×10⁶个/ml的密度稀释至新摇瓶中进行扩增，摇瓶置二氧化碳摇床36.5±0.5℃，6±1％CO₂，130r/min；每次扩增培养3±1天，扩增2次，扩增过程中活细胞密度不超过6.0×10⁶个/ml；

所述基础培养基为：Dynamis AGT 24.8g/L；所述补料培养基为：EfficientFeed C+AGT176.4g/L；葡萄糖浓缩液为：葡萄糖200g/L。

2.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，所述种子培养基为：CD CHO AGT 24.6g/L。

3.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，步骤4)中，将发酵培养液经过离心处理后，先采用Q Sepharose Fast Flow填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl平衡后上样，上样，收集穿透液，用pH3.5的20mM NaAC-HAC溶液对穿透液进行稀释，稀释1倍；然后采用SPSepharose FastFlow填料在4℃条件下，用0.5M NaOH、2M NaCl处理后，用pH3.5的20mMNaAC-HAC平衡，之后上样，用pH3.5的20mM NaAC-HAC+0.2M NaCl溶液和pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠溶液洗出杂蛋白后，再用pH6.0的80mM柠檬酸-柠檬酸钠+0.5M NaCl溶液洗脱重组血小板源生长因子，收集重组血小板源生长因子。

4.根据权利要求1所述的一种表达生产重组血小板源生长因子的方法，其特征在于，所述rhPDGF-BB氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。