[发明专利]芽孢形成相关基因spoⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用

权利要求书

1.芽孢形成相关基因spo ⅡE在影响菌株生长及产酶中的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)提取克劳氏芽孢杆菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，制得克劳氏芽孢杆菌芽孢形成相关基因spo ⅡE，基因spo ⅡE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)以pHT01质粒为模板进行PCR扩增，扩增获得Cm^r片段，Cm^r片段的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；

(3)将步骤(1)制得的基因spo ⅡE与步骤(2)制得的Cm^r片段采用重叠PCR进行融合，获得融合基因spo ⅡE-Cm^r；

(4)将步骤(3)的融合基因spo ⅡE-Cm^r经酶切后，浓缩，然后转化克劳氏芽孢杆菌，经筛选得阳性菌株，即可应用于菌体生长与产酶；所述浓缩后的融合基因spo ⅡE-Cm^r的浓度为300～500ng/μL；

所述产酶为产淀粉酶，淀粉酶的酶活是出发菌株的5～6倍。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

spo ⅡE-F：CGCGGATCC CCTTAAAAGCGGAGCCAAAAC；

spo ⅡE-R：GCCAGCAAAAAGCGTTCCTACAAGTAAGCC；

PCR扩增体系如下，总体积50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，引物spo ⅡE-F 2.5μL，引物spo ⅡE-R 2.5μL，克劳氏芽孢杆菌基因组DNA 2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min45s，共30个循环；72℃继续延伸10min。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：

Cm^r-F：CTTGTAGGAACGCTTTTTGCTGGCCTTTTGCTC；

Cm^r-R：CGCGGATCC TAGTGACTGGCGATGCTG；

PCR扩增体系如下，总体积50μL：

2×HiFi-PCR Master 25μL，引物Cm^r-F 2.5μL，引物Cm^r-R 2.5μL，pHT01质粒2.5μL，ddH₂O 17.5μL；

PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min40s，共30个循环；72℃继续延伸10min。