[发明专利]一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用

说明书

一株大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用，该大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌株于2018年6月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018403；其分类命名为大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），拉丁文学名Escherichia coli Nissle（Tum 5‑p53）。本发明构建的大肠杆菌EcN（Tum 5‑p53），含有抗肿瘤低氧表达载体pET28a‑Pvhb‑SUMO‑Tum 5‑MMP‑p53，能高效表达双功能蛋白Tum 5‑p53，能将抗血管生成因子Tum‑5和肿瘤抑制蛋白p53传递至实体瘤，发挥良好的抗肿瘤疗效。该株抗肿瘤靶向工程菌对荷人肝癌SMMC‑7721裸鼠的肿瘤抑制率高达69.47%。

技术领域

本发明涉及一株抗肿瘤靶向工程菌，具体涉及一株大肠杆菌Nissle 1917抗 肿瘤靶向工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

癌症严重威胁人类生命健康。传统的癌症治疗方法，如手术治疗、放疗和化 疗，通常不能完全消除肿瘤厌氧微环境中的肿瘤细胞。利用靶向传递载体将抗癌 基因或抗肿瘤药物递送到肿瘤低氧区域进行癌症治疗，是近年来迅速发展的一种 最具有临床应用前景的癌症治疗方法。

E.coli Nissle 1917(EcN)最初由军人外科医生AlfredNissle从一名士兵的 粪便中分离出来，该士兵在严重的志贺氏菌病爆发期间没有出现腹泻。近年来， 肠道益生菌EcN已被制备成药物用来治疗腹泻和溃疡性结肠炎疾病 (BiochemistryBiokhimiia.2010；75(4):481-485)。Zhang等利用EcN用作基 因治疗的传递载体，将EcN静脉注射荷瘤小鼠，解剖小鼠获得肺、肝、脾、肾、 心脏和肿瘤组织后研磨涂平板，发现EcN能特异性地靶向肿瘤区域(Applied and Environmental Microbiology.2012；78(21):7603-7610)。Jochen等以静脉注 射、腹腔注射和瘤内注射三种不同的注射方式，将EcN注射荷瘤小鼠以研究其 靶向性，研究结果显示，无论以哪种注射方式，EcN都能在肿瘤区域定殖和生长，而在其它内脏器官中未发现细菌的存在(International Journal ofMedicalMicrobiology Ijmm.2007；297(3):151-162)。鉴于EcN高度的肿瘤靶向特性， 及其在脾脏和肝脏组织能及时被机体有效清除，所以选择EcN作为靶向传递抗 肿瘤蛋白的载体，传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区，在未来癌症治疗中将是一个有 前景的肿瘤治疗途径。

CN 107574138A公开了一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与 应用，其所述大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株，即Escherichia coliNissle 1917 (Tum-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017345。 该抗肿瘤靶向工程菌含有抗肿瘤分泌表达载体pET28a-Pvhb-SUMO-Tum 5，能可 溶性表达和分泌性表达肿瘤抑素Tumstatin的抗肿瘤血管生成活性区域Tum-5； 该株抗肿瘤靶向工程菌对荷B16黑色素瘤C57BL/6小鼠的肿瘤抑制率为52.95％。

目前，大肠杆菌EcN虽然对实体瘤具有高度靶向性，能在肿瘤低氧区域特 异性定殖，可作为传输载体传送抗肿瘤活性蛋白至肿瘤区域；但真核抗肿瘤蛋白 在原核细菌中表达时存在困难：蛋白可溶性表达情况欠佳、容易形成包涵体蛋白、 难以获得具有正常空间结构的活性蛋白；另外，由于肿瘤细胞发展的抗药性可能 使药物再次使用时治疗效果差；单一基因治疗肿瘤时也存在疗效持续性差等缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株肿 瘤靶向性较高、经济性较好和安全性高的大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程 菌。

本发明进一步要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一 种大肠杆菌Nissle 1917抗肿瘤靶向工程菌的构建方法。