[发明专利]酸性磷酸酶的制备方法

说明书

本发明公开了酸性磷酸酶的制备方法。该方法包括使该酸性磷酸酶的编码基因在生物中进行表达的步骤；所述生物为微生物、植物或非人动物；该酸性磷酸酶为a)或b)或c)或d)：a)由SEQ ID No.2第1‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQ ID No.2第26‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。本发明可用于培育高效活化土壤磷素养分的生物工程菌。

本申请是申请号为201610051653.1、申请日为2016年01月26日、发明创造名称为“来源于巨大芽孢杆菌的酸性磷酸酶及其编码基因与应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物领域中酸性磷酸酶的制备方法。

背景技术

磷是植物生长发育三大必需元素之一，在生命过程中起重要作用。植物利用的磷素主要来源于土壤。目前，我国有2/3的耕地缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷含量不足，大约95％的磷为难溶性的无效磷，植物很难吸收利用。我国每年大约消耗1050-1200万吨磷肥(2010年中国化工信息网)，但是磷肥当季植物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定。因此，提高磷肥利用效率，活化土壤无效磷素是农业生产迫切解决的科学问题之一。

溶磷微生物中酸性磷酸酶、肌醇六磷酸酶在土壤有机磷的分解与释放起着关键作用(Yamamura et al.,2004；赵小蓉等，2001；陈哲等，2009)。酸性磷酸酶(Acidphosphatase，简称ACPase，E.C.3.1.3.2)，是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶。此酶除了参与磷酸酯的代谢，还参与代谢调节、能量转换以及信号转导等重要生命活动。酸性磷酸酶具有非常重要的功能，其一，酸性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性，通过分解有机质的磷一酯键和磷一酐键释放磷，从而活化土壤中无效磷，在充分利用土壤磷资源、减少磷肥施用上具有重要应用价值；其二，酸性磷酸酶也具有磷酸转移酶活性,在合适的条件下,能将低能磷酸基团转移到核苷的羟基上,在核苷酸生化合成上具有较大的应用价值。核苷酸通常作为食品添加剂和医药中间体，其中，肌苷酸(次黄嘌呤-5′-核苷酸)因为具有更明显的助鲜效果，广泛应用于食品加工领域。目前主要有两种方法生产核苷酸，一种是化学合成法，利用菌体发酵产生肌苷，再用POCl₃磷酸化，该方法副产物较多，提纯困难；另一种方法是利用大肠杆菌肌苷激酶磷酸化肌苷，此过程需要ATP的参与，而ATP需要通过产氨杆菌发酵再生，限制了酶法合成的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种磷酸水解酶的活性和磷酸转移酶活性均较高的酸性磷酸酶。

本发明所提供的酸性磷酸酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)由SEQ ID No.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b)由SEQ ID No.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端(C末端)或/和氨基端(N末端)融合蛋白标签得到的融合蛋白；

d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。

上述酸性磷酸酶中，a)所示的蛋白质为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的完整酸性磷酸酶，其名称为BmacpA；SEQ ID No.2由203个氨基酸残基组成，第1-25位为信号肽。

上述酸性磷酸酶中，b)所示的蛋白质为去掉BmacpA的信号肽得到的去信号肽酸性磷酸酶，其名称为NSBmacpA。