[发明专利]基于特征肽段定量大鼠CYP2E1酶的检测方法及检测试剂盒在审
申请号: | 201810890345.7 | 申请日: | 2018-08-07 |
公开(公告)号: | CN108956839A | 公开(公告)日: | 2018-12-07 |
发明(设计)人: | 余鹏;邱朝辉;孟凡奇;蒋蕾;丁尧;张可 | 申请(专利权)人: | 余鹏 |
主分类号: | G01N30/88 | 分类号: | G01N30/88 |
代理公司: | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人: | 周宇 |
地址: | 410000 湖南*** | 国省代码: | 湖南;43 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 肽段 大鼠 检测试剂 内标 标记肽段 检测 样本 稳定同位素标记 线性回归方程 合成 标准血清 待测样本 回归方程 进样分析 线性回归 样品定量 对照品 前处理 色谱峰 蛋白质 验证 筛选 分析 研究 | ||
1.基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述检测方法包括以下步骤:
合成根据设计的第一定量肽段、第二定量肽段、第一标记肽段和第二标记肽段并制备梯度浓度的第一定量肽段工作液、第二定量肽段工作液、第一标记肽段工作液和第二标记肽段工作液;
将所述第一定量肽段工作液和所述第二定量肽段工作液加入大鼠血清,分别配制成梯度浓度标准血清样本,加入第一标记肽段工作液和第二标记肽段工作液作为内标,进行液相色谱-质谱分析,得到第一标准曲线和第二标准曲线;
将待测样本经变性、还原化、烷基化后酶解,得到酶解片段,分成两份,分别为第一检测样本和第二检测样本,所述第一检测样本与所述第一标记肽段工作液混合得到第一待检样本,所述第二检测样本与所述第二标记肽段工作液混合得到第二待检样本,所述第一待检样本和所述第二待检样本分别进行液相色谱-质谱分析,得到第一检测数据和第二检测数据;
将所述第一检测数据基于第一标准曲线计算得到第一含量值,将所述第二检测数据基于第二标准曲线计算得到第二含量值,综合所述第一含量值和第二含量值,得到样本中大鼠CYP2E1酶的含量。
2.根据权利要求1所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述第一定量肽段和所述第二定量肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示;所述第一标记肽段的同位素标记方式为:FINL(13C615N1)VPSNLPHEATR;所述第二标记肽段的同位素标记方式为GII(13C615N1)FNNGPTWK。
3.根据权利要求1所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述液相色谱-质谱分析中,液相色谱的条件为ACQUITY Peptide C18柱(2.1mm×50mm,1.7μm),柱温50℃,进样室温度10℃,进样量为5μL,流动相包括流动相A和流动相B,所述流动相A为0.2%的甲酸溶液,所述流动相B为乙腈溶液;流速为0.4mL/min,流动相的梯度为:
0min,A:95%、B:5%;
1min,A:95%、B:5%;
5min,A:88%、B:5%;
10min,A:80%、B:5%;
11min,A:80%、B:20%;
12min,A:40%、B:60%;
14min,A:10%、B:90%;
15min,A:10%、B:90%;
16.5min,A:95%、B:5%。
4.根据权利要求1或2所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,酶解所述待检样本前处理包括:将待检样本变性处理,加入二硫苏糖醇溶液,反应后加入碘乙酰胺溶液避光震荡,加入胰蛋白酶液水解后,加入终止液,离心取上清液得到所述酶解片段。
5.根据权利要求4所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述变性的温度为94-97℃,时间为100-150s。
6.根据权利要求5所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述二硫苏糖醇溶液的浓度为28-33mM,所述二硫苏糖醇溶液由50mM的NH4HCO3缓冲液稀释得到。
7.根据权利要求4所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,所述碘乙酰胺溶液的浓度为75-82mM。
8.根据权利要求4所述的基于特征肽段定量检测大鼠CYP2E1酶的检测方法,其特征在于,加入所述胰蛋白酶液前还包括加入50mM的NH4HCO3缓冲液漩涡混合。
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