[发明专利]检测栗黑水疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法和用途

说明书

本发明公开了一种检测栗黑水疫霉菌的LAMP引物对及其扩增方法与用途，属于植物病原真菌检测领域，自行设计合成了1套引物PC‑F3、PC‑B3、PC‑FIP和PC‑BIP，优化反应体系及扩增程序，建立了一种快速简便、特异性强、准确可靠的植物及植物产品中栗黑水疫霉菌分子检测方法，一个工作日内完成整个检测，用于对栗黑水疫霉基因组DNA的特异检测。

技术领域

本发明涉及使用LAMP技术检测植物及植物产品中栗黑水疫霉菌的方法，属于植物病原真菌检测领域。

背景技术

栗黑水疫霉，是我国检疫部门十分重视的检疫性真菌。它除了能引起栗树黑水病，还可在许多果树上引起根、茎腐烂病。栗树黑水病的病菌通常侵染树干基部和较大的根，引起树干和根腐烂，病菌侵染初期，症状不明显；后期，树叶变小，变黄，脱落，或者不表现明显症状，而树木很快死亡。该病菌与其他根部腐烂病害典型的根部变软、水状腐烂的症状不同，感染后，主要症状为，根部腐烂使被侵染的根部变褐、变硬、变脆，危害严重。

栗黑水疫霉引起的疫病已成为多个国家水果产业面对的难题，是国内各水果进境口岸重点关注的疫情之一。

目前疫霉菌常规生物学检测方法是植物带菌检测，经过分离培养可通过肉眼直接观察菌落、孢子囊、卵孢子等形态特征来进行鉴定。病原菌菌株培养时间需达20天左右才能诱激产生孢子囊，此种情况不仅耗时费力， 疫霉病原菌的形态特征、培养性状及生理特性等极为相似，很难根据菌落形态、孢子囊的形态和脱落性、有性器官的产生和形态、厚垣孢子的有无、菌丝的生长温度等特性来准确、快速有效地鉴定出栗黑水疫霉，分子生物学方法如ELISA（Mohan. Evaluation of antisera raised against Phytophthora fragariaefor detecting the red core disease of strawberries by enzyme-linkedimmunosorbent assay (ELISA). Plant Pathology1988, 37:206-216)、单克隆抗体(Burns et al. The use of monoclonal antibodies for the detection of fungi.Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. 1995, 25:31-38)等已有应用，但是只能检测到疫霉属的水平。目前的检测方法不能满足口岸检测“快验快放”的要求，易导致病害在我国传播。因此，加强对口岸进境植物产品携带疫霉的快速、准确的检测鉴定显得极为重要。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增方法。该技术有灵敏度高、特异性强、方便简捷、检测周期短、仪器设备要求低等优点，大大降低了投入成本，具有较高的应用价值，目前已广泛应用于临床、食品安全、农业等领域。在植物病毒、细菌方面的应用也已相当成熟，如Fukuta等应用LAMP先后检测番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）和番茄斑萎病毒（TSWV），Okuda等建立了黄龙病的LAMP检测方法等。但还没有将LAMP技术应用于栗黑水疫霉检测的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：设计栗黑水疫霉的LAMP引物，建立栗黑水疫霉的LAMP检测方法。

为了解决该问题，本发明的解决方案是，设计栗黑水疫霉的特异LAMP引物，用于栗黑水疫霉基因组DNA特异性检测。栗黑水疫霉的LAMP特异引物，序列如下：

PC-F3 ：TCT GTC CTA GGT CCA CCA T

PC-B3：CTA CAA TTC CGA ATA ATC ACA GTG T

PC-FIP：TGA TGG TCT TGC CGT CCA GTG ACC TCC AGG CTG ACG TTA T