[发明专利]一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法

说明书

本发明公开了一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，本发明使用直接购买的OPA，通过原位反应，实现了对3种常见而难以区分的硫醇分子的检测(Cys、Hcy和GSH)，以及检测体系中，三甲基十六烷基溴化铵(CTAB)的加入有效增强了OPA对3种硫醇分子的荧光响应灵敏度。并且本发明方案可运用于细胞内硫醇分子的检测及生物成像，同时避免了繁琐复杂的有机合成步骤。本发明公开的识别生物硫醇分子的方法不仅操作简便，而且原料生物毒性低、结构简单、易得，极具市场应用与推广价值。

技术领域

本发明属于硫醇分子检测技术领域，涉及一种用于区分响应半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的方法策略，尤其涉及一种基于原位反应的识别策略。本发明同时还涉及OPA检测细胞内硫醇分子的应用。

背景技术

众所周知，小分子硫醇类化合物在生物体系内扮演着举足轻重的角色。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是生物体内常见的三种小分子硫醇化合物，因其具有相似的结构与物理化学性质，难以实现对三者的有效区分。

另一方面，现如今荧光探针因其高灵敏度及高分辨度，被认为是一种高效的可以特异性检测及时跟踪监测生物细胞或组织内样品可视化的一种分析方法。因此，开发一种简单而又高效的荧光探针，可以在水相、有机相、细胞内特异性且高分辨率的区分三种硫醇类底物的可行性已得到充分验证，其工作的重要性自不言而喻。

在过去十年中，由于分子探针结构简单和非侵入的特性，大量的活细胞中检测巯基的荧光探针已被开发出来。半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)作为难以区分且重要的生物硫醇，是其中重要的研究课题之一。在已报道的硫醇化合物的探针中，我们可以看到有很多具备创新型和巧妙思路的设计。尽管如此，利用探针完全区分三种硫醇的测试方法仍然非常少见。

因此，如何提供一种操作简便且高效检测生物硫醇分子的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种利用OPA特异性识别生物硫醇分子的方法，所述方法具体包括如下步骤：

步骤一：在比色管中加入磷酸缓冲溶液，并以所述磷酸缓冲溶液作为溶剂；

步骤二：向步骤一的溶剂中加入OPA的二甲基亚砜溶液后，再向其中加入生物硫醇分子摇匀，并分别运用紫外吸收仪和荧光仪获得识别检测结果。

通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明所使用的探针分子邻苯二甲醛(OPA)具备生物毒性低、结构简单、原位识别、零背景的检测优点，可以实现对目前难以区分的三种硫醇分子的识别响应(Cys、Hcy和GSH)。

其中，反应型探针OPA为直接购置产品，其结构式为：

OPA通过与硫醇分子的原位反应生成1-烷硫基-2-烷基取代异吲哚结构，硫醇分子结构的差异直接导致生成产物的荧光性质，从而成为一种高灵敏度、高区分度的硫醇分子识别策略。

另外，发明人通过核磁共振氢谱和高分辨质谱等手段进行表征，证实OPA对3种硫醇分子的检测基于原位反应生成的新荧光团。

其识别检测机理如下所示：

本发明公开的以探针OPA与含有氨基硫醇分子的click反应作为基本作用机制，并以反应生成的1-烷硫基-2-烷基取代异吲哚结构作为荧光信号报告基团，3种硫醇分子所引起的荧光信号差异与其分子结构相关，从而达到生理条件下对3种硫醇分子同时响应并可获得有效区分。