[发明专利]一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。本发明通过将外源蛋白表达基因克隆入表达载体中，得到能在啮齿类动物体内细胞表达的重组载体；分别于0d、15d、30d、60d和90d，通过啮齿类动物尾静脉将重组载体直接注射至啮齿类动物体内，得到外源蛋白体内快速积累模型。该外源蛋白体内快速积累模型能用于评估外源蛋白体内风险。本发明具有如下优点：在3个月内完成构建，可通过调整注射频率和注射剂量实现对体内外源蛋白剂量的调控；可同时构建多种待评估的外源重组载体，高通量评估；可放大外源蛋白暴露浓度，缩短评估周期。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种外源蛋白体内快速积累模型及其制备方法与应用。

背景技术

对于转基因蛋白的长期累积的毒理性研究，常规的口服途径方法耗时长,成本高。“放大”肝组织内转基因成分浓度的方法可以成为口服给药毒理性研究的一种补充途径。

通常情况下，转基因蛋白在植物细胞的保护下进入肠胃道后的命运推测为两种，即一部分转基因蛋白在坚硬的植物细胞壁的保护下抵制胃酸、胰蛋白酶等消化酶的作用进入肠组织(谢雯琦，马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100)。进入肠胃组织的转基因蛋白首先会通过门静脉进入肝脏，其中大部分接受肝组织内代谢酶的生物转化，随后代谢物通过血液进入体循环如被输送至心脏等器官，少量转基因蛋白原型仍保留在肝中(刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。另一部分转基因蛋白在肠道释放后虽未被代谢，但会被水解酶降解为多肽易被小肠绒毛组织吸收，并通过跨细胞作用进入皮下组织进而进入体循环(Ledley F D.Somatic gene therapy in gastroenterology:approaches andapplications.Journal of pediatric gastroenterology and nutrition.1992，14:328～337；ChangA G and Wu G Y.Gene therapy:applications to the treatment ofgastrointestinal and liver diseases.Gastroenterology.1994,106：1076～1084)，或被小肠中M细胞胞吞、内化和胞饮等转运到上皮细胞下的淋巴组织，进而诱导免疫应答(谢雯琦,马三梅，王永飞,等.转基因番茄口服疫苗的现状，问题及对策.中国生物工程杂志.2014,34(10)：94～100；刘建平著.生物药剂学与药物动力学.人民卫生出版社.2011)。结合目前研究转基因植物的安全性评估结果可以验证上述推测，即肝脏组织中负责肝细胞代谢、应激反应和线粒体代谢的蛋白表达降低，这一结果(Malatesta M et al.Finestructural analyses of pancreatic acinar cell nuclei from mice fed ongenetically modified soybean.European Journal of Histochemistry.2003,47(4):385～388)提示，一部分转基因蛋白的肝代谢作物明显，随后，转化后的代谢物进入体循环后被输送至各组织而引起潜在的心脏疾病(Tudisco R,et al.Fate of transgenic DNAand evaluation of metabolic effects in goats fed genetically modified soybeanand in their offsprings.Animal.2010，4(10):1662～1671)，另一部分通过小肠吸收后进入体循环而引起淋巴器官的异常(Séralini G E，et al.Long-term toxicity of aRoundup herbicide and a Roundup-tolerant genetically modifiedmaize.Environmental Sciences Europe.2014，26：14)，最终，转基因蛋白的代谢物经肾脏排泄，从而又表现出对肾肿瘤形成的潜在影响。