[发明专利]一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法

说明书

本发明涉及发酵工程领域，具体是一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法。苹果酸脱氢酶是细胞中心氧化通路的关键酶，并且有相关报道其与细菌鞭毛运动有着密切关联，本发明通过溴甲酚绿，进行初筛，筛选出产酸性较强的菌株；利用MTT检测菌株的动力性，进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选准确的筛选出高产MDHs的低温菌株，最后通过检测酶活，来最终确定高产菌株。本发明可在20天内方便、准确地筛选低温高产胞内苹果酸脱氢酶的细菌菌株，弥补了苹果酸脱氢酶筛选培养基相关领域的空白。

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，具体是一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法。

背景技术

MDHs(低温苹果酸脱氢酶)作为生物体中心代谢途径的关键酶，在遗传变异和个体发育等具有重要的研究价值，并在临床诊断、工业检测具有广泛应用，市场需求量与日俱增，价值巨大。自上世纪50年代，就已经有学者从动物心肌中分离出MDHs。现阶段，市场上商业化的MDHs来源主要是猪、兔、牛的心肌、肝脏、骨骼肌中提取。原料成本低、来源广，但提取工艺繁琐，产品酶活较低。因此，拓展新的来源显得尤为重要。而海洋微生物是巨大的资源宝库。从中筛选新型的、低温的、高活性的目的MDHs产生菌株显得尤为重要。MDHs广泛存在于自然界生物体内，但如何准确筛选出高产MDHs菌株，目前没有具体的方法。

由于目前对产MDHs的菌株筛选没有具体相关的筛选方法，因此，研究其筛选方法对高产MDHs的研究十分必要。

发明内容

为筛选出高产MDHs细菌菌株，本发明提供一种新的筛选方法，采用溴甲酚绿-MTT二步的筛选方式筛选出高产低温苹果酸脱氢酶活性强的细菌菌株。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)从深海海泥、海水中采集样本；

(2)初筛：步骤(1)中采集的样本进行梯度稀释，涂布于含有溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基，25℃，恒温培养3-4天；

(3)纯化：挑取步骤(2)中生长旺盛、黄绿色透明圈较大的菌落接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基进行分离纯化，25℃，恒温培养1-2天，此步骤重复2-4次；

(4)复筛：将步骤(3)纯化的菌落用接种针沾取单个菌落，穿刺接种至MTT牛肉膏蛋白胨半固体培养基1/3深度；

(5)筛选：选取沿穿刺线扩散到未穿刺的培养基部位呈弥漫蓝色云雾状的菌株，接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，25℃，恒温培养1-2天；

(6)将步骤(5)得到的菌株以5％接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，150rad，25℃，摇床培养1-2天，菌体超声破碎，测酶活，筛选产酶活性高的菌株，得到高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，步骤(2)中含溴甲酚绿的牛肉膏蛋白胨固体培养基的溴甲酚绿含量为0.1-0.2g/L。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，步骤(3)中MTT牛肉膏蛋白胨半固体培养基的MTT的含量为0.015g/L。

上述一种筛选高产低温苹果酸脱氢酶细菌菌株的方法，所用培养基均由海盐水配制。

本发明利用MDHs可以催化草酰乙酸生成L-苹果酸这一特性，通过溴甲酚绿，进行初筛(溴甲酚绿在pH＝3.8时呈黄色，pH＝5.4时呈蓝绿色)，筛选出产酸性较强的菌株，利用MTT来检测菌株的动力性，来进行第二次筛选，选择动力性较强的菌株测酶活，通过双重筛选，可以从茫茫菌株中缩小范围，更加快捷、准确的筛选出高产MDHs的低温菌株，最后通过检测酶活，来最终确定高产菌株。