[发明专利]一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用

权利要求书

1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)间充质干细胞的分离与培养：将滑膜标本用 75%乙醇表面消毒，PBS 缓冲液洗涤，置于培养皿中，用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片，置于离心管中，加适量 PBS 缓冲液，离心，弃去上清，加入适量 II 型胶原酶，摇床振荡(200rpm，37℃)后，离心弃去胶原酶，最后在组织碎片中加入适量含 10％FBS 的低糖 DMEM 培养液，而后转移到培养皿中，置于培养箱中培养，两天后将组织块转移置新的培养皿中，继续培养两天而后弃去组织块，直到间充质干细胞长满培养皿；

(2)间充质干细胞的鉴定：将细胞消化、重悬、离心、用 PBS 缓冲液洗涤，调整细胞密度为 2×10⁶/ml 左右，取 100μl 待测细胞悬液，加入抗 CD44、CD90、CD105 以及 CD45、CD34的单克隆抗体，避光常温反应 30min，而后离心、弃上清，收集细胞，PBS 缓冲液冲洗，4%多聚甲醛固定，最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况；

(3)软组织的培养与分离：将第三代间充质干细胞消化、计数，接种于 12 孔板中，1 .2×10⁶/孔，用含有 0 .3mMAsc-2P 的低糖 DMEM 培养液培养，2-3 天更换一次培养液，10-14 天后弃去培养液，而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织，将软组织置于滤纸上，除去培养基，用镊子轻轻夹起，检测软组织的弹性，将软组织置于 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，进行HE 染色；

(4)软骨分化能力检测：将软组织置于 12 孔板内，使用低糖 DMEM培养 1 天使其充分贴壁，然后更换培养基为软骨培养基，置于培养箱中培养，隔几天更换一次培养液，培养结束后，利用 RNA 试剂盒提取纯化 RNA，而后反转录，最后根据 SYBRPremixExTaqTMII 试剂盒的说明操作，并用荧光定量 PCR 仪检测 ColII、SOX9 以及 AGN 的表达；

所述低糖 DMEM 培养液包括含 10％FBS 的低糖 DMEM 培养液和含有 0 .3mMAsc-2P的低糖 DMEM 培养液；

步骤(1)中用乙醇消毒次数为 2 次，PBS 缓冲液洗涤次数为 2 次；摇床振荡时间为2h；培养箱是 37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱；

步骤(4)中置于培养箱中培养的时间为 2 周，每 3 天更换一次培养液。

2.根据权利要求 1 所述方法制备得到滑膜间充质干细胞的软组织。