[发明专利]一种ERG1基因缺陷酵母工程菌、其构建方法及其运用

权利要求书

1.一种敲除酵母菌ERG1基因的方法，所述方法包括：

(1)筛选ERG1基因的gRNA位点；

(2)构建敲除ERG1基因的表达载体；

(3)改造Cas9载体，将p414-TEF1p-Cas9-CYC1t的筛选标记TRP替换为LEU；

(4)获取ERG1基因的双链DNA(dsOligo)

(5)制备酵母化学感受态细胞；

(6)将敲除了ERG1基因的表达载体、改造好的Cas9载体以及合成的ERG1双链DNA转化至骤(5)中的感受态细胞中，获得突变成功的ERG1基因缺陷的酵母菌。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法为：

(1)筛选ERG1基因的gRNA位点，所述gRNA位点的基因序列为：

TATCTTTTCACGTTTCAGAA；

(2)以EGR1-F和EGR1-R为引物，以p426-SNR52p-gRNA真核表达载体为模板克隆得到线性载体，并以T4连接酶进行平末端连接，构建得到敲除ERG1基因的gRNA表达载体，

所述引物序列为：

ERG1-F：TATCTTTTCACGTTTCAGAAGTTTTAGAGCTAGAA，

ERG1-R：GATCATTTATCTTTCACTGCGGAGAAG；

(3)改造Cas9载体，将p414-TEF1p-Cas9-CYC1t的筛选标记TRP替换为LEU；

(4)设计敲除ERG1基因的dsOligo，通过同源重组修复对目的基因进行敲除，所述ERG1-Oligo-F及ROX1-Oligo-R的序列为：

ERG1-Oligo-F：

CAGGTTATTTCGAACAATTGAAAAAAAAAAATCACAGAAAAACATATCGAGAAAAGGGTCCTACAGCTTATAAGGGAGAGAGGATAGGAACCGTCAAACATTAAGCTGCACCTTTTTTTT，

ERG1-Oligo-R：

AAAAAAAAGGTGCAGCTTAATGTTTGACGGTTCCTATCCTCTCTCCCTTATAAGCTGTAGGACCCTTTTCTCGATATGTTTTTCTGTGATTTTTTTTTTTCAATTGTTCGAAATAACCTG，

所述ERG1基因的dsOligo获得通过将ERG1-Oligo-F及ROX1-Oligo-R退火形成DNA双链，并回收纯化既得；

(5)根据Frozen-EZ Yeast Transformation II ^TM试剂盒说明书制备酵母化学感受态细胞；

(6)将含有酵母ERG1基因的特异性识别位点的gRNA载体、改造好的Cas9载体以及合成的ERG1双链DNA转化至骤(5)中的感受态细胞中，在筛选培养基SC-Leu-Ura上无氧培养，获得突变成功的ERG1基因缺陷的酵母菌。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述酵母菌为GEN.PK系酿酒酵母菌或BY系酿酒酵母菌，优选为BY系酿酒酵母，如BY4741酿酒酵母。

4.一种基因缺陷型酵母工程菌，所述基因缺陷型酵母工程菌为缺失了ERG1基因的酵母工程菌。

5.根据权利要求4所述的基因缺陷型酵母工程菌，其中所述酵母工程菌为GEN.PK系酿酒酵母菌或BY系酿酒酵母菌，优选为BY系酿酒酵母，如BY4741酿酒酵母。

6.权利要求4或5所述的酵母工程菌，缺失ERG1基因的方法是通过权利要求1或2所述方法获得的。

7.权利要求4或5所述基因缺陷型酵母工程菌在验证鲨烯环氧化酶基因功能中的运用。

8.权利要求4或5所述基因缺陷型酵母工程菌在验证植物细胞中鲨烯环氧化酶基因功能中的运用，如植物雷公藤中鲨烯环氧化酶。