[发明专利]雷公藤三萜合酶TwOSC1及其编码基因与应用

说明书

本发明涉及一种雷公藤三萜合酶TwOSC1蛋白及其编码基因，将Twosc1基因的cDNA克隆到真核表达载体pYES2，构建带有Twosc1基因的重组表达载体，转入酵母表达宿主菌，可生产得到一些三萜类化合物，如木栓酮、香树素等。通过突变研究结果表明，Twosc1基因编码的氨基酸486和502为关键位点，可以提高或降低木栓酮或香树素的产量。通过基因枪介导的干扰实验表明，Twosc1基因的干扰对于雷公藤中雷公藤红素的合成有明显的抑制作用,通过进一步实验，采用基因枪介导的过表达实验表明，Twosc1基因的过表达可以提高雷公藤悬浮细胞中雷公藤红素的产量。本发明TwOSC1蛋白及其编码基因可用于生物合成植物三萜类化合物，以及培育高品质的雷公藤。

技术领域

本发明涉及一种雷公藤三萜合酶及其编码基因，以及该三萜合酶及其编码基因在三萜类化合物生物合成中的运用，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

中药雷公藤来源于药用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)的干燥根的木质部，被广泛用于类风湿性关节炎和炎症的治疗(Raphaela G M,Mildred W,Roy F,et al.Comparison of Tripterygium wilfordii Hook F Versus Sulfasalazine in theTreatment of Rheumatoid Arthritis:A Randomized Trial[J].Annals of InternalMedicine,2009,151(4):229-240.Tao X L,Lipsky P E.The Chinese anti-inflammatoryand immunosuppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F.[J].Rheumatic Disease Clinics of North America,2000,26(1):29–50.)。萜类成分为雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚内酯(triptophenolide)和雷公藤红素(celastrol)等。从中药中的活性成分开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，再加上这些有效成分在植物体中的含量不多，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在雷公藤中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。

雷公藤中以木栓烷型的雷公藤红素为代表的三萜类化合物具有抗炎、抗风湿、抗肿瘤、减肥、免疫抑制、治疗神经性疾病等活性(Liu J,Lee J,Salazarhernandez M A,etal.Treatment of Obesity with Celastrol[J].Cell,2015,161(5):999–1011.)。通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(MVA)pathway)和质体的2-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(Isopentenyl pyrophosphate(IPP))及其异构体Dimethylallyl pyrophosphate(DMAPP)。再由此分别生成单萜(monoterpenes)，倍半萜(sesquiterpenes)，二萜(diterpenes)和三萜(triterpenes)的底物香叶基焦磷酸(Geranyl diphosphate(GPP)),法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate(FPP))和牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate(GGPP))。