[发明专利]热稳定胆固醇酯酶突变体OPE-S109

说明书

本发明提供热稳定胆固醇酯酶突变体OPE‑S¹⁰⁹P/S²⁷¹P及其制备方法，所述突变体序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用软件，结合突变体自由能的变化值，构建突变体电子文库；从结构合理的突变体中，筛选出突变位点位于β‑转角的突变体，进行分析：组成β‑转角氨基酸残基z_B‑factor的平均值大于零；组成β‑转角氨基酸残基z_RMSF的平均值大于零；突变位点所的β‑转角柔性值大于1；与热稳定蛋白β‑转角氨基酸偏好性相同。满足上述两个条件的突变体组成微型突变文库。利用上述方法构建所述突变体，阳性突变体频率为33.3%，有效降低筛选工作量；获得突变体的失活半衰期较野生型OPE延长了3.6倍。

技术领域

本发明涉及一种热稳定胆固醇酯酶突变体OPE-S¹⁰⁹P/S²⁷¹P及其制备方法，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

胆固醇酯酶（Sterol esterase，EC 3.1.1.13），是一类能催化胆固醇酯酯键断裂或合成的水解酶。胆固醇酯酶活性中心催化三联体由丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸三个氨基酸残基构成。胆固醇酯酶具有广谱底物特异，除了催化胆固醇酯水解外，还能催化磷脂、维生素酯、酰化甘油酯、酯酰辅酶A等底物的水解（或合成），胆固醇酯酶甚至还能表现出酰胺酶（Amidase）的多功能催化活性。胆固醇酯酶在血清胆固醇酯的定量测定、有机合成（尤其是甾醇衍生物类药物的合成）、造纸（纸浆树脂障碍的控制）、特殊日用品（如隐形眼镜）的保洁、食品加工、高分子材料的合成（或降解）等领域具有广泛的应用，是一类具有重要经济价值的工业生物催化剂。目前，仅动物源的胰腺胆固醇酯酶得到系统深入的研究，但该类胆固醇酯酶的催化活性高度依赖于胆盐（Bile salt）的激活；同时，在有胆盐的缓冲溶液中，胰腺胆固醇酯酶常以多聚体（如二聚体或六聚体）的形式存在。微生物源胆固醇酯酶尚缺乏深入系统的研究，零星报道的某些具有胆固醇酯酶活性的酶蛋白，其实质是脂肪酶（lipase,EC 3.1.1.3），是脂肪酶表现出来的多功能催化活性。

筛选胆固醇酯酶的热稳定性突变体，有助于优化胆固醇酯酶的催化工艺（如胆固醇酯酶的溶解性较低，构建热稳定性胆固醇酯酶突变体，提高反应温度，有助于促进底物的溶解，增大反应物底物浓度，促进反应速率）；此外，对于延长胆固醇酯酶的货架周期，也具有重要的意义。传统构建热稳定性突变体的方法多基于构建庞大的突变体文库和高通量筛选技术基础上实现的，该方法阳性突变率低，费时费力，筛选工作量巨大。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了热稳定胆固醇酯酶突变体OPE-S¹⁰⁹P/S²⁷¹P及其制备方法，获得比野生型胆固醇酯酶具有更好热稳定性的突变体，提高胆固醇酯酶在工业上的应用价值。

本发明的目的之一：热稳定胆固醇酯酶突变体OPE-S¹⁰⁹P/S²⁷¹P，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述胆固醇酯酶热稳定性突变体的编码基因，序列如SEQ IDNO.2所示。

热稳定性胆固醇酯酶突变体的第109位氨基酸发生了突变，由丝氨酸突变为脯氨酸，同时第271位氨基酸也发生了突变，由丝氨酸突变为脯氨酸。该胆固醇酯酶突变体的半失活温度为53.3℃，比野生型胆固醇酯酶提高8.9℃；半衰期为76.6 min，比野生型胆固醇酯酶延长了3.6倍。

本发明的目的之二：提供了一种高效率获得热稳定性胆固醇酯酶突变体蛋白的制备方法。

包括以下步骤：

(1)利用YASARA软件优化胆固醇酯酶3D结构图；

(2)基于胆固醇酯酶突变体自由能的变化值，ΔΔG＜0 KJ/mol，并利用多种生物信息学软件，构建热稳定胆固醇酯酶突变体电子文库；

(3)进一步利用多种生物信息学软件筛除突变体电子文库中3D结构不合理的热稳定胆固醇酯酶突变体；