[发明专利]一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用

说明书

本发明公开了一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统，是由Ti双元质粒pB01和含有pB01的宿主细胞构成；其中所述Ti双元质粒pB01是以pCMBIA1300质粒为骨架，由T‑DNA的左边界和右边界序列、草丁磷除草剂抗性基因表达盒、含有氨苄抗性基因表达盒和完整的广谱复制起始位点元件的质粒拯救系统的核心部件构成；含有pB01的宿主细胞是根瘤农杆菌菌株。本发明遗传转化系统的应用可弥补传统遗传转化系统存在的转化效率低、转化子遗传稳定性差、随机插入无法确实插入位点等缺陷，有助于对丝状真菌进行功能基因的标记以及标记基因的分离，将成为是最具潜力的开展真菌基因功能、真菌分子遗传学研究的有效方法。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种高效便利定位基因插入座位的丝状真菌遗传转化系统及其应用。

背景技术

丝状真菌作为一种低等的高等生物，在工业、农业、医药等领域具有重要的研究与经济价值。在工业方面，以黑曲霉(Aspergillus niger)和米曲霉(Aspergillus.oryzae)为代表的丝状真菌基因具有分泌性能高、表达量大、发酵工艺成熟等优点，已被广泛用于生产酶类(如蛋白酶和淀粉酶)和有机酸(如柠檬酸等)的工业生产中，具有重大的经济应用价值。许多丝状真菌是重要农作物的致病菌(稻瘟病)，粮食等贮藏过程中的腐败变质的主要原因也是丝状真菌；同时，又有一些丝状真菌(白僵菌、绿僵菌、哈氏木霉等)由于其可寄生于有害昆虫并将其致死的特性，可用于作物病虫害的生物防治。在医药方面，如产黄青霉(Penicillium chrysogenum)和顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)分别能产生青霉素和头孢菌素，可用于疾病的治疗；一些丝状真菌也与疾病有关，如黄曲霉素产生的黄曲霉一种重要的致癌因子。另外，丝状真菌在基础生物学研究中也具有重要作用，其具有坚硬的几丁质细胞壁；顶端生长特性；营腐生或寄生生活；孢子繁殖；基因组相对较小；多余DNA含量少等特点，使得丝状真菌成为对分子遗传学理论研究极具意义的模式生物[李娟,杨金奎,梁连铭,张克勤.丝状真菌遗传转化系统研究进展.江西农业大学学报.2006,28(4):516-520.]。

尽管丝状真菌具有重要的研究与经济价值，但长期以来，迫切需要一个有效工具实现外源基因的非定点/定点整合、基因敲除、目的基因超表达、大规模突变解析功能基因组等目的，缺少一个有效的转化系统一直限制着丝状真菌理论与应用研究的发展，有效的转化方法是丝状真菌基因工程的前提。