[发明专利]一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法及所用的地高辛标记DNA探针

权利要求书

1.一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)取待检测菌株单菌落点于硝酸纤维素膜制成待检膜，对待检膜进行预处理得到预处理DNA膜，将所得的预处理DNA膜置于杂交液中，在40～45℃条件下培育40～50min，得到预杂交液；

2)将地高辛标记的DNA放入沸水中处理8～12min后置于冰浴中冷却，得到标记DNA溶液，取标记DNA溶液加入至步骤1)所得的预杂交液中配制混合液，所用标记DNA溶液与预杂交液的体积比5：(1.2～1.8)，混匀静置后将混合液中的膜体取出得到二次处理DNA膜；

3)将步骤2)所得的二次处理DNA膜加入至杂交液中，并加入地高辛标记DNA探针，于40～45℃下作用45～60min，随后将膜去除放至盛有2×SSC溶液的容器中洗涤1～3次，每次3～7min，得到三次处理DNA膜

4)将步骤3)所得的三次处理DNA膜置于缓冲液中清洗30～90s，弃去缓冲液再加入1～3％VOL的封闭液，室温放置40～70min，弃去封闭液再加入碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液，于35～39℃条件下温育20～30min，弃去碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体溶液并用冲洗液冲洗2～6次，随后置于显色缓冲液中平衡90～150s，弃去显色缓冲液后加入BCIP/NBT显色液，置于暗处至显色后加入TE缓冲液终止反应，得到终处理DNA膜；

5)将步骤4)所得的终处理DNA膜进行观察，有斑点出现表示结果为阳性，即为产生膝沟藻毒素的微生物菌株，反之无斑点出现的表示结果为阴性；

所述地高辛标记DNA探针为SEQ ID NO.1：

5'-CCTCCTTAGCCTCCTGGTCCCTCCTTGGACTAGGCACCTCCTTACGTCACTTAGCCCTCCTGCTGTCGACCTCCTACGAATATCGATCCGAGGCCTCCTACGCCGGCTAGGCCTTCGCCGACTCCTCCTCCCTCCTGGCGCCCTCCTGCCTCCTGGCGGCACGTGACTCTCAACGCACGCTCCTCCCTCCTCTGAACGTCGGCAGGACCCTTAGGCAGCAGCACCTAGGCTCCGCCTTGTGCAAGTCC-3'。

2.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，所述预处理步骤包括将待检膜浸于0.3～0.8mol/L的NaOH溶液中5～15min，浸渍后置于60～90℃条件下干燥1～2h以固定DNA，再将其置于3～8mg/mL、pH为7.6～8.3的溶菌酶溶液中，在35～39℃条件下温水浴15～30min，以TE缓冲液冲去膜表面细菌细胞残留物。

3.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤1)和步骤3)所述杂交液为在2×SSC溶液中加入45～55mmol/L的磷酸缓冲液和0.8～1.2mmol/L的EDTA，并含有7.5～12.5wt％硫酸葡聚糖和45～55wt％去离子甲酰胺的混合液，杂交液pH值为6.8～7.2。

4.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述缓冲液中含有0.08～0.115mol/L的顺丁烯二酸和0.115～0.165mol/L的NaCl，缓冲液pH值为7.4～7.6。

5.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述封闭液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl、0.13～0.165mol/L的NaCl和0.085～0.125mol/L的MgCl₂，封闭液pH值为7.8～8.1。

6.根据权利要求1所述的一种快速筛选产生膝沟藻毒素微生物菌株的方法，其特征在于，步骤4)所述冲洗液中含有0.08～0.115mol/L的Tris-HCl和0.13～0.165mol/L的NaCl，冲洗液pH值为7.3～7.7。