[发明专利]滇重楼胆甾醇C22羟化酶及其编码基因和应用有效

专利信息
申请号: 201810900161.4 申请日: 2018-08-09
公开(公告)号: CN108998428B 公开(公告)日: 2019-07-26
发明(设计)人: 张夏楠;尹艳;高琳惠;高伟 申请(专利权)人: 首都医科大学
主分类号: C12N9/02 分类号: C12N9/02;C12P33/06;C12N15/82;C12N15/81;C12N1/19;A01H5/00;A01H6/56;C12R1/865
代理公司: 北京天奇智新知识产权代理有限公司 11340 代理人: 陆军
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摘要:
搜索关键词: 胆甾醇 滇重楼 羟化酶 编码基因 植物育种 类化合物 生物合成 薯蓣皂苷 羟化 合成 应用
【说明书】:

发明涉及一种滇重楼胆甾醇C22羟化酶及其编码基因,所述滇重楼胆甾醇C22羟化酶可以使胆甾醇的C22位进行羟化,继而合成滇重楼的薯蓣皂苷类化合物。本发明还涉及胆甾醇C22羟化酶及编码基因在植物育种及生物合成中的运用。

技术领域

本发明涉及一种滇重楼胆甾醇C22羟化酶及其编码基因,以及滇重楼胆甾醇C22羟化酶及编码基因在植物育种及生物合成中的运用,属于药用成分合成生物学领域。

通过聚合酶链式反应首次克隆得到了滇重楼(Paris polyphylla Smithvar.yunnanensis(Franch.)Hara)中胆甾醇C22羟化酶基因(PpCYP90B27)的cDNA全长序列,然后利用合成生物学手段,构建酵母工程菌,在酵母中生产22(R)-羟基胆甾醇。

背景技术

滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hara)是我国著名的药用植物之一,主要活性成分为根茎中提取的重楼甾体皂苷(约占化合物数目的80%),研究表明其具有强烈的药理活性,以其根茎为主要原料制成的中成药云南白药、宫血宁、热毒清等,临床用于治疗功能性子宫出血、神经性皮炎、外科炎症以及肿瘤等具有显著的疗效,具有极高的经济价值和市场前景。然而由于滇重楼种子有“二次休眠”生理特性,繁殖率低,根茎的自然生长速度也十分缓慢,从种子成长为药用商品一般需要10-15年,严重制约了滇重楼产量,市场缺口较大,货源紧缺,供不应求,价格飞涨。因此,改善滇重楼植物资源,通过科学手段寻找能够高效积累或生产重楼甾体皂苷的途径是重楼当前急需解决的问题。重楼皂苷属于甾体皂苷,其苷元主要为异螺旋甾烷醇类(isospirostanols,C25为R构型)的薯蓣皂苷元(diosgenin)和偏诺皂苷元(pennogenin)(薯蓣皂苷元为主)。胆甾醇(cholesterol)是薯蓣皂苷元(diosgenin)生物合成途径中的一个重要前体。胆甾醇侧链经过C-22的羟基化等一系列反应生成的中间体环化为半缩酮,继而生成薯蓣皂苷元的螺缩酮结构。CYP90B27基因编码的单加氧酶即为负责甾体皂苷途径上胆甾醇下游第一步羟化的P450酶基因。因此CYP90B27的活性能够直接影响薯蓣皂苷的生物合成。滇重楼胆甾醇C22羟化酶基因(PpCYP90B27)基因的克隆,为利用发酵工程大量生产活性成分重楼皂苷提供重要基础。在本发明被公布之前,尚未有任何公开或报道过本发明中所提及的滇重楼胆甾醇C22羟化酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

本发明一方面提供了一种分离的蛋白,即胆甾醇C22羟化酶,所述蛋白参与甾体皂苷类化合物的生物合成,尤其是参与薯蓣皂苷类化合物的生物合成,如将胆甾醇转化为22-羟基胆甾醇。

本发明所述羟化酶,是一种参与滇重楼甾体皂苷类化合物合成,尤其是22-羟基胆甾醇合成的关键酶,所述酶具有如下氨基酸序列:

(1)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列;

(2)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或多个氨基酸且功能相同的蛋白。

本发明中,所述分离的蛋白,即胆甾醇C22羟化酶,是指:具有对胆甾醇C22羟化活性的酶,其序列如SEQ ID NO:2所示,当然还包括具有与天然胆甾醇羟化酶相同功能的SEQID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。胆甾醇C22羟化酶还包括其活性片段和活性衍生物。

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