[发明专利]一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，将两个降解相关的表达载体pRSFDuet‑nidA‑nidB和pCDFDuet‑fdr‑fdx共转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到工程大肠杆菌HY1，其中pRSFDuet‑nidA‑nidB表达载体插入了两段多环芳烃降解基因nidA和nidB；pCDFDuet‑fdr‑fdx表达载体插入了两段多环芳烃降解基因fdr和fdx。大肠杆菌工程菌表达了外源的降解基因，能够表达多环芳烃羟基化双加氧酶活性；提高了菌株对多环芳烃的降解能力。为以后多环芳烃污染物降解修复提供了新方法，为菌株的进一步开发和改造提供了实验基础。

技术领域

本发明涉及一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，属于生物降解领域和基因工程领域。

背景技术

随着煤和石油大量开采和广泛应用，其采集、精炼、运输、燃烧等过程产生的多环芳烃被大量累积。多环芳烃是指分子中含有2个或2个以上苯环的碳氢化合物，如萘、蒽、菲、芘、联苯、三联苯等。多环芳烃广泛存在于土壤、水体和空气中，水溶性差、具有热稳定性，而且其中相当的一部分都具有慢性毒性和致癌、致畸、致突变的“三致”作用，对人类健康和生态环境造成了巨大危害，是环境中一类危险而需重点研究的化合物。

生物法是利用生物体自身的生命活动来降解、利用这些污染物，并将其转化为结构简单无毒或低毒的物质，是一种成本低廉、无二次污染、修复彻底的环境修复技术。多环芳烃生物修复主要是指依靠微生物降解环境中的有毒有害污染物，并分解为无毒无害的CO₂和H₂O。但是自然环境中的多环芳烃野生降解菌对多环芳烃的降解率较低，因此考虑开展基因工程菌株的构建，将不同降解基因组合，构建出强化版工程菌株。构建基因工程菌可以解决单一降解菌应用的局限性及混合菌竞争抑制等问题，最重要的是可以大幅度提高对污染物的降解效率。

重组基因技术的不断进步促进了基因工程的发展，以基因工程的思想改造菌种是一种达到定向目的的手段。虽然很多大肠杆菌(Escherichia coli)本身并不能降解多环芳烃，但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌，其基因组和蛋白质组的信息比较全，代谢途径也比较清楚，而且一些大肠杆菌中存在多环芳烃降解基因，所以利用基因重组及其他分子生物学手段构建降解多环芳烃污染物的工程大肠杆菌是可行的。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌及其构建方法和应用，使得大肠杆菌可以对多环芳烃污染物进行更高效率地降解。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

一种降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌，其特征是将两个降解相关的表达载体pRSFDuet-nidA-nidB和pCDFDuet-fdr-fdx共转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中得到工程大肠杆菌HY1，其中pRSFDuet-nidA-nidB表达载体插入了两段多环芳烃降解基因nidA和nidB；pCDFDuet-fdr-fdx表达载体插入了两段多环芳烃降解基因fdr和fdx。

作为优选，根据Mycobacterium vanbaalenii PYR-1的降解基因nidA和nidB序列，根据Alcanivorax borkumensis SK2的降解基因fdr和fdx序列，在金唯智生物科技有限公司进行针对E.coli BL21(DE3)的密码子优化，并合成nidA(如SEQ ID No.1所示核苷酸序列)和nidB(如SEQ ID No.2所示核苷酸序列)；fdr(如SEQ ID No.3所示核苷酸序列)和fdx(如SEQ ID No.4所示核苷酸序列)。

原始底盘细胞为E.coli BL21(DE3)购买自北京全式金生物技术有限公司。

pRSFDuet和pCDFDuet质粒购买自淼灵生物科技有限公司。

本发明的降解多环芳烃污染物的大肠杆菌工程菌构建方法，包括以下步骤：