[发明专利]一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法

说明书

本发明涉及一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs来提高乙酸同化能力，首先是扩增目标基因，并在其两端加入酶切位点，构建质粒，制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞，将构建好质粒进行电转化，筛选阳性菌落进行验证，最后对验证正确的菌株进行mcl‑PHA生产测试。本发明特点是：既提高了Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力，同时又促进代谢流流向脂肪酸合成通路，从而提高了mcl‑PHA前体(R)‑3‑Hydroxyfatty acid的合成，进而提高了mcl‑PHA的产量。

技术领域

本发明涉及一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(PHA)，是一类由羟基脂肪酸为单体组成的聚酯，可被大多数微生物合成，其具有与石油基高分子聚合物相近的物理和机械特性，同时还具有生物可降解性、生物相容性等优良特性，因此被视为石油基高分子聚合物的优良替代品之一。根据单体的碳原子数不同，可将其分为短链聚羟基脂肪酸酯(3-5个碳原子，scl-PHA)和中长链聚羟基脂肪酸酯(6-14 个碳原子，mcl-PHA)。其中，中长链PHA较短链PHA具有更丰富的结构，因此其更容易被改造用于特殊应用。例如中长链PHA具有低结晶度，低玻璃化转变温度，低拉伸强度和高断裂伸长率等特性，因此可作为弹性复合物用于需要柔性生物材料的一系列生物医学应用，例如用于制造人工心脏瓣膜或控制药物输送的材料等。

但是高额的生产成本严重限制了中长链PHA的广泛应用。大量研究者开展了降低mcl-PHA生产成本的工作。研究表明，发酵底物的成本占总生产成本的50％左右，因此，利用廉价非相关碳源生产PHA是一种降低PHA生产成本的重要手段。乙酸是一种非常有前景的碳源，其价格便宜，广泛存在于废液和生物质水解液中，此外，乙酸还能通过产气菌直接发酵大量存在于自然和工业气体中的单碳气体生成，最近也有研究表明可以利用合成气电合成乙酸， Pseudomonas putida KT2440(恶臭假单胞菌KT2440)天然具有mcl-PHA合成能力，已被广泛用于合成mcl-PHA的研究，包括通过代谢改造手段强化其利用木糖、葡萄糖等非相关碳源生产mcl-PHA的能力等，但其对于乙酸的利用还未见报道，因此本发明通过代谢改造提高 Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力，提高mcl-PHA的合成，同时，Pseudomonasputida KT2440也是经过美国NIH认证的“安全、非病原菌”，营养需求低，鲁棒性高，是一种优良的工业应用菌株，提高其利用廉价乙酸的能力，也有助于利用廉价碳源合成其他高附加值产品。

发明内容

鉴于上述，本发明提出一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法。

本发明通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs(如图1所示) 来提高乙酸同化能力，首先是扩增目标基因，并在其两端加入酶切位点，构建质粒，制备 Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞，将构建好质粒进行电转化，筛选阳性菌落进行验证，最后对验证正确的菌株进行mcl-PHA生产测试。

本发明的技术方案如下：

一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法；通过过表达Pseudomonas putida KT2440乙酸同化通路关键基因acs来提高乙酸同化能力。

本发明的一种提高Pseudomonas putida KT2440乙酸同化能力的方法，具体步骤如下：

(1)体外扩增目标基因，构建过表达质粒；

(2)制备Pseudomonas putida KT2440电转化感受态细胞；