[发明专利]抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种抗PD‑1单克隆抗体及其制备方法和应用，公开了抗PD‑1单克隆抗体、抗体的制备方法、抗体在制备用于多种疾病中药物的用途，还涉及本发明提供的抗体可配对使用检测抗原的用途。

技术领域

本发明涉及生物医药和基因工程技术领域，具体涉及一种抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种抗人PD-1兔源单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1)，也称为CD279，是一种重要的免疫抑制分子，属于免疫球蛋白超家族CD28家族成员，分子量在50～55kD的I型跨膜糖蛋白。PD-1主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞上(YasutoshiAgata等，Internationl Immunology 1996；8：675)。作为T细胞的负性调控因子，PD-1与其配体PD-L1/PD-L2一同参与T细胞免疫过程。已有大量研究证实，PD-1在体内炎症和肿瘤免疫过程中发挥重要作用。PD-1/PD-L1调节轴在人体T细胞活化控制与机体免疫耐受维持中发挥关键作用，因此也被肿瘤细胞以及慢性病毒感染中所利用。PD-1/PD-L1调节轴已被证实促进T细胞耗竭，肿瘤或病毒诱导的PD-1/PD-L1信号通路也可通过多种机制来实现宿主免疫监视的逃逸，包括促进T细胞失活、衰竭、反应迟钝和细胞凋亡，诱导Treg细胞扩增，以及增强肿瘤内在性抵抗杀伤和凋亡的能力。通过癌细胞介导的PD-1和PD-L1相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，T细胞增殖抑制，并增加免疫逃逸(Topalian SL等，Cancer Cell，2015)。在慢性乙肝病毒感染过程中，CD8+T细胞表面的PD-1表达与病毒载量相关，开始抗病毒治疗后病毒载量和PD-1表达均下降，且阻断PD-1通路有助于HBV相关CD8+T细胞的功能恢复(Hsiang-Yun Cheng等，PLoS ONE 2014；Na Li等，Oncotarget，2017)。因此，将PD-1为癌症、感染性疾病和炎性疾病免疫治疗靶点，已成为目前免疫治疗的一个研究热点。

除了表达于细胞表面的的膜结合型PD-1(membrane boundprogrammed death-1,mPD-1)之外，PD-1还有一种存在于血液中的由PD-1Deltaex3可变区编码的可溶性形式——可溶性程序性死亡分子-1(soluble programmed death-1,sPD-1)。sPD-1可以在功能上阻断mPD-1的调控作用，影响T细胞的增殖，并促进抗原特异性T细胞免疫及树突状细胞的成熟。动物实验显示sPD-1可以抑制肝癌细胞的生长，促进癌细胞溶解，最终提高患癌小鼠的总体生存率(Elhag OA等，Asian Pac J Cancer Prev.2012)。有研究发现，慢性HBV感染患者的血清sPD-1水平高于健康人及HBV清除者。对于CHB不同分期而言，免疫耐受期的sPD-1水平与非免疫耐受期存在明显的差别。高水平的sPD-1还与持续的高病毒载量及高肝癌风险有关(Na Li等，Oncotarget，2017；Hsiang-Yun Cheng等，PLoS ONE 2014)。已发生HCC患者的sPD-1水平显著高于未发展为肝癌者，sPD-1对于诊断肝癌有最高的灵敏度和特异度，提示sPD-1也可以应用于慢性HBV感染患者的病情评估及预后判断。因此，精准测量检测血清中sPD-1浓度将帮助临床医生判断患者的免疫状态，从而更好地做出治疗决策。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种抗PD-1单克隆抗体及其制备方法和应用，尤其是涉及一种抗人PD-1兔单克隆抗体及其制备方法和应用，所提供的PD-1单克隆抗体可配对使用，可通过双抗体夹心ELISA法实现对PD-1和sPD-1蛋白的精确检测。

为实现上述目的，本发明提供如下方案：

一方面，本发明提供一种抗PD-1单克隆抗体，其包括重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5所示；