[发明专利]烟草悬浮细胞的培养方法

权利要求书

1.烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于按照以下步骤进行：

步骤1：无菌苗及愈伤组织的获得；

(1)将烟草种子依次用清水冲洗，用乙醇浸泡，无菌水冲洗，H₂O₂浸泡，无菌水冲洗，播种于MS固体培养基中；

(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，获得无菌组培苗；

(3)将无菌幼苗叶片剪成小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中，温室内暗培养，长出乳白色愈伤组织；

步骤2：愈伤组织的继代培养；

取长势较好，无褐化的愈伤组织转接到新的相同培养基中，2周转接一次，保证愈伤组织的营养含量及无菌环境，继代3代后，得到分散性较好且松脆的愈伤组织；

步骤3：悬浮细胞体系的建立；

取愈伤组织碾碎，接种到悬浮细胞液体培养基，保证装悬浮细胞液体培养基的容器的溶氧和通气充分；

步骤4：悬浮细胞的再培养；

将上层的悬浮细胞液转移到无菌空三角瓶中继续振荡培养，3天后采用同样的方法再转接一次，7-8天后采用同样的方法再转接一次，将悬浮细胞经筛网过滤后接种到新鲜培养基中继续振荡培养，用同样的方法连续培养3代后，可获得稳定且分散性较好的悬浮细胞，建立稳定的烟草细胞悬浮培养体系。

2.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中(1)将烟草种子用清水冲洗数次，用75％乙醇浸泡30秒，无菌水冲洗3次，15％H₂O₂浸泡15min，无菌水冲洗5次，播种于MS培养基中，所有操作均在超净工作台中操作；

(2)将无菌幼苗转接到MS固体培养基中培养，4周后获得无菌组培苗；

(3)在超净工作台中，将无菌幼苗叶片剪成5mm*5mm小块，平铺于愈伤组织诱导培养基中(MS固体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L)，温室内26±2℃暗培养4-5周，长出乳白色愈伤组织。

3.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(1) 中培养条件为26±2℃，光照强度1000-2000lux，16h光照，8h黑暗，湿度30％-60％。

4.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中悬浮细胞液体培养基为MS液体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L。

5.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中悬浮细胞液体培养基(MS液体培养基+NAA2.72mg/L，6-BA0.85mg/L，2,4-D0.34mg/L)，pH值为5.8，采用150ml三角烧瓶装液30-50ml，液体培养基的容量介于1/5--1/3，保证容器的溶氧和通气充分，摇床转速为110-130r/min，温度26±2℃，采用透气封瓶膜封口，适宜细胞生长。

6.按照权利要求1所述烟草悬浮细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中细胞悬浮培养温度为26±2℃，30g/L蔗糖为碳源，振荡转速120r/min，初始培养基pH5.8。