[发明专利]一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

权利要求书

1.一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；

步骤二、构建pdICP4-CEA-promoter质粒：用EcoRI/XhoI双酶切消化的方式把由CMV启动子控制的人CEA启动子序列从质粒pcDNA3.1-CEA-promoter中释放出来，用T4DNA多聚酶处理后克隆入步骤一所得质粒pdICP4-promoter的限制性内切酶EcoHV酶切位点处，从而构建质粒pdICP4-CEA-promoter；

步骤三、BHK细胞内同源重组I型单纯疱疹病毒17+株：将步骤一中去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株与步骤二中质粒pdICP4-CEA-promoter共同转染BHK细胞，使这两者在BHK细胞发生同源重组，获得表达CEA启动子的重组病毒载体17-d4-CEA-promoter；

步骤四、构建pdICP34.5质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游侧翼序列，得到的ICP34.5上游和下游侧翼序列两个片段用重叠PCR进行连接，随后把连接后的产物插入预先用限制性内切酶BamHI/XhoI消化后的质粒pSP72中，用T4DNA多聚酶补平质粒的粘性末端，得到的质粒命名为pdICP34.5；

步骤五、构建质粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代质粒pcDNA3.1-CEA-promoter中的CEA-promoter，产生质粒pcDNA3.1-hIL-12；把来自质粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表达盒克隆入质粒pdICP34.5的Afel位点处，创建质粒pdICP34.5-hIL-12；

步骤六、步骤五中的质粒pdICP34.5-hIL-12用来删除步骤三中重组病毒载体17-d4-CEA-promoter中ICP34.5基因，从而构建出溶瘤病毒HSV^CEA+IL-12。

2.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤一中的ICP4启动子中，

上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterUSf为AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；

下游序列ICP4-promoterUSr为AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；

下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP4-promoterDSf为AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；

下游序列ICP4-promoterDSr为AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。

3.根据权利要求1所述的一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，其特征在于，步骤四中的ICP34.5基因中，

上游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5USf为CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；

下游序列ICP34.5USr为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；

下游侧翼序列的引物对包括：上游序列ICP34.5DSf为GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；

下游序列ICP34.5DSr为TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。