[发明专利]一种D-氨基酸的制备方法

权利要求书

1.一种D-氨基酸的制备方法，其特征在于，以D-氨基酰化酶和N-乙酰氨基酸消旋酶为酶催化剂，N-乙酰氨基酸为底物原料；包括如下步骤：1、重组菌构建：克隆N-乙酰-D-氨基酰化酶基因，基因连入pET系列载体或pKK223-3载体，转化至BL21(DE3)宿主菌，构建D酰化酶重组菌；克隆N-乙酰-氨基酸消旋酶基因，基因连入pET系列载体或pKK223-3载体，转化至BL21(DE3)宿主菌，构建N-乙酰氨基酸消旋酶重组菌；2、重组菌发酵；3、固定化酶制备；4、固定化酶转化联合膜分离；5、产品结晶；

其中，固定化酶转化及膜分离的具体步骤：称取底物N-乙酰-L-氨基酸，加水溶解，调pH6-9，控制温度30-45℃，加入固定化酶NLase和固定化酶NAAR，加入氯化钴，100-300rpm搅拌反应，反应完成后，滤液通过90-150nm的纳滤膜处理，副产物乙酸钠大部分透出，而底物和产物D-氨基酸被截留，截留液返回反应器继续反应直至底物完全水解为D-氨基酸。

2.根据权利要求1所述一种D-氨基酸的制备方法，其特征在于，N-乙酰-D-氨基酰化酶基因来源于Alcaligenes denitrificans或Aspergillus oryzae或Defluvibacter或Hypomyces mycophilus或Methylobacterium mesophilicum或Sebekia或Stenotrophomonas maltophilia或Streptomyces或Trichoderma sp.。

3.根据权利要求1所述一种D-氨基酸的制备方法，其特征在于，N-乙酰-氨基酸消旋酶基因来源于Sebekia Benihana或Amycolatopsis orientalis subspecies lurida或Amycolatopsis azurea或Deinococcus radiodurans或Geobacillus kaustophilus或Defluvibacter或Alcaligenes xylosoxydans subsp.xylosoxydans。

4.根据权利要求1所述一种D-氨基酸的制备方法，其特征在于，固定化酶制备的具体操作步骤包括：

1）取重组菌发酵所得的菌体，加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；

2）高速离心，获得上清酶液；

3）酶液加入菌体量50%-200%的固定化载体EP200，20-30℃震荡混合12-24h；

4）过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液洗涤，过滤，得固定化酶；磷酸钾缓冲液为20-100mM，pH7-8.5。