[发明专利]一种H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法

权利要求书

1.一种检测H7亚型禽流感病毒引物对和探针组，其特征在于，所述的引物对和探针序列信息如下：

正向引物：

5′-GCRATGCAAAATAGAATACAGAT-3′(SEQ ID NO:1)

反向引物：

5′-AAGCTAAACCARAGTATCACATC-3′(SEQ ID NO:2)

探针：

5′-CCRGTCAAACTAAGCAGCGGYTA-3′(SEQ ID NO:3)。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记。

3.权利要求1所述的引物对和探针组在制备检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测H7亚型禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的引物对和探针组。

5.一种检测临床样品中H7亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管25μL，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ 12.5μL，5U/μL TaKaRa ExTaq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5μL，10pmol/μL权利要求1所述的引物对和探针各0.5μL，RNase Free dH2O 8.0μL，待检测的样品RNA模板2μL；

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；保存文件，运行；

3)结果判定

结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤28.0，并出现特定的扩增曲线；如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效；

结果描述及判定:无Ct值并且无扩增曲线，样品判为阴性；Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，样品判为阳性。