[发明专利]一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基

权利要求书

1.一种用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基，其特征在于：

每1升种子液培养基含有：胰蛋白胨5-7g、酵母提取物10-14g、甘油4-6g、Na₂HPO₄10-11g、KH₂PO₄2-3g；

每1升发酵基础培养基含有：胰蛋白胨10-14g、酵母提取物22-26g、甘油8-12g、Na₂HPO₄5-6g、KH₂PO₄ 1-1.5g、MgSO₄溶液:1-3ml；

每1升发酵补料培养基含有：葡萄糖160-200g；

每100mL微量营养液含有：MgSO₄ 2.5g、Nacl 10g、L-谷氨酰胺5g、甘氨酸2g、NaH₂PO₄5g。

2.根据权利要求1所述用于裸质粒pSFVK1-NMM生产的大肠杆菌发酵培养基，其特征在于，所述大肠杆菌发酵培养基的制备方法如下：

种子液培养基每1升的制备方法为：称量胰蛋白胨5-7g、酵母提取物10-14g、甘油4-6g、Na₂HPO₄ 10-11g、KH₂PO₄ 2-3g，加入去离子水溶解，定容到1000mL，121℃高压灭菌20min后4℃保存备用；

发酵基础培养基每1升的制备方法为：称量胰蛋白胨10-14g、酵母提取物22-26g、甘油8-12g、Na₂HPO₄ 10-11g、KH₂PO₄2-3g,加入去离子水溶解，定容到1000mL，121℃高压灭菌30min后4℃保存备用；在发酵培养开始前，每1升发酵基础培养基加入MgSO₄溶液1-3ml；

MgSO₄溶液制备方法为：称量MgSO₄固体50g，加入去离子水溶解，定容到100mL，0.22um滤膜除菌过滤后4℃保存备用；

发酵补料培养基每1升的制备方法为：称量葡萄糖180g,加入去离子水溶解，定容到1000mL，115℃高压灭菌30min后4℃保存备用；

微量营养液每100mL的配置方法为：称量MgSO₄ 2.5g、Nacl 10g、L-谷氨酰胺5g、甘氨酸2g、NaH₂PO₄ 5g，加入去离子水溶解，定容到100mL，0.22um滤膜除菌过滤后4℃保存备用。

3.XL10-Gold/pNMM工程菌种子库的构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)制备原始种子库：将所述工程菌XL10-Gold/pNMM活化至含卡那霉素的LB固体平板中30℃培养，挑取单克隆接种到含5mL LB培养基的试管中30℃过夜培养12h，再接种到含20mL LB的离心管中30℃过夜培养12h，加入甘油至终浓度20％，分装10管冻存于-80℃冰箱中保存，得到原始种子库；

(2)制备主种子库：复苏一支原始种子接种于8管LB液体培养基中，传代后提取质粒，选取质粒特异性产率最高的菌液扩大培养至含100mL LB培养基中，在30℃，200RPM下培养12h后加入甘油至终浓度20％，分装50管冻存于-80℃冰箱中保存，得到主种子库；

(3)制备工作种子库：复苏一支主种子接种于8管LB液体培养基中，传代后提取质粒，选取质粒特异性产率最高的菌液扩大培养至含100mL LB培养基中，在30℃，200RPM下培养12h后加入甘油至终浓度20％，分装50管冻存于-80℃冰箱中保存，得到工作种子库。每支工作种子库中的菌种限传五代用于NMM肿瘤融合抗原裸质粒pSFVK1-NMM的生产。