[发明专利]一种流感病毒HA融合肽和helix A蛋白制备方法及其应用与引物

说明书

本发明公开了一种流感病毒HA融合肽+helix A蛋白表达载体的制备方法及其应用与引物。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX‑6p‑1线性化载体以及流感病毒HA融合肽‑helix A基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆HA融合肽‑helix A，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现流感病毒HA融合肽‑helix A蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的HA融合肽‑helix A融合蛋白。

技术领域

本发明涉及一种流感病毒HA融合肽和helix A蛋白制备方法及其应用。此发明可直接提供HA融合肽和helix A融合蛋白作为免疫原获得抗HA融合肽和helix A多克隆抗体。本发明将为进一步探究HA的融合肽以及helix-A区域能否作为有效抗原表位，刺激机体产生中和抗体，评价其广谱流感中和亚单位疫苗打下了基础，提供了材料。

背景技术

疫苗以及抗病毒药物的使用对流感病毒的防控作出了积极贡献。但由于流感病毒抗原的持续变异以及重组病毒的不断出现，时常导致人流感的大流行以及禽流感的爆发，严重影响人类健康以及畜牧业的持续发展。根据流感病毒表面两个主要抗原蛋白HA以及NA的抗原性，目前流感病毒可以分为18个HA以及11个NA亚群。根据HA的结构及其抗原性，18个HA亚群又可进一步归为GROUP1以及GROUP2两大类。值得注意的是，目前流感病毒疫苗均为亚群特异或毒株特异的疫苗，一般只能对相应的特定亚群或毒株提供有效保护，而对其它亚群或毒株往往不能提供有效保护。另外，流感病毒耐药毒株的不断出现也大大限制了抗流感病毒药物的使用。因此，筛选18个HA亚型中的保守中和表位，研制流感病毒广谱通用疫苗一直是流感病毒免疫防控研究中的一大热点。利用单克隆抗体技术，国内外研究发现，这些广谱的流感病毒中和抗原表位位于流感病毒HA的融合肽以及helix A区域。然而，HA的融合肽以及helix A区域能否作为流感病毒广谱亚单位疫苗尚无定论。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种流感病毒HA融合肽和helix A蛋白表达载体的制备方法及其应用与引物，并实现HA融合肽和helix A蛋白的表达。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及流感病毒HA融合肽和helix A基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆HA融合肽和helix A，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现流感病毒HA融合肽和helix A蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的HA融合肽和helix A融合蛋白。

本发明公开了PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物以及PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helix A基因引物序列，所述引物如下：

a,PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物：

上游引物：5‘taatgacggtgaaaacctctgacacatgc 3’；

下游引物：5‘catgggcccctggaacagaacttccagat 3’。

b,PCR扩增AIV病毒HA融合肽和helix A基因引物：

上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGGGAAGCggcctatttggtgctat 3’；

下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTAgtttaattttcctgt 3’。

本发明还公开了一种流感病毒HA融合肽和helix A蛋白制备方法：基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1线性化载体与流感病毒HA融合肽和helix A基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现HA融合肽和helixA融合蛋白表达。