[发明专利]一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接ELISA检测方法

权利要求书

1.一种检测新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒包含包被有新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的酶标板；所述新型鸭呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201843。

2.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的制备方法如下：

以保藏编号为CCTCC NO：V201843的新型鸭呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体，通过原核表达系统表达新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原；

所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，将所述重组表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原。

4.根据权利要求1所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白重组抗原的包被量为500ng/孔。

5.根据权利要求1-4任一项所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述间接ELISA检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。

6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为酶标羊抗鸭抗体。

7.权利要求1-6任一项所述的间接ELISA检测试剂盒在新型鸭呼肠孤病毒的流行病学调查中的应用；

所述新型鸭呼肠孤病毒的保藏编号为CCTCC NO：V201843。

8.一种新型鸭呼肠孤病毒抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被：以保藏编号为CCTCC NO：V201843的新型鸭呼肠孤病毒σC重组蛋白作为包被抗原，将抗原稀释后加入到酶标板孔中，4℃孵育过夜或37℃孵育2-4h，采用含0.05％吐温的PBST洗涤；

(2)封闭：采用PBST稀释5％脱脂奶粉200μL/孔进行封闭，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；

(3)血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用PBST洗涤；

(4)添加酶标抗体：将酶标羊抗鸭抗体用PBST按1：500稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用PBST洗涤；

(5)底物显色：TMB显色液100μL/孔，37℃条件下避光作用15min；

(6)终止反应：每孔加50μL终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；

(7)阴阳性临界值的确定：根据公式：阴阳性临界值＝阴性样本OD₄₅₀平均值+标准偏差3SD，得到阴阳性临界值；当OD₄₅₀在0.072以上，判定为阳性。

9.根据权利要求8所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，步骤(1)中，所述新型鸭呼肠孤病毒σC重组蛋白由如下方法制备而成：

以保藏编号为CCTCC NO：V201843的新型鸭呼肠孤病毒的全基因序列为模板，利用引物对扩增得到σC基因片段，构建重组表达载体；将重组表达载体转化至BL21(DE3)感受态细胞中，加入IPTG进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的新型鸭呼肠孤病毒σC重组蛋白；

所述引物对的序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。