[发明专利]一种减毒棒状病毒的制备方法及应用

权利要求书

1.一种减毒病毒载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（S1）将如SEQ ID NO:1所示的编码水疱性口炎病毒基质蛋白的基因的核苷酸序列和第一载体混合，加入转座酶进行转座反应；

（S2）将步骤（S1）得到的转座产物和感受态细菌混合，进行转化；

（S3）提取通过步骤（S2）得到的细菌的质粒，得到转座后的所述编码水疱性口炎病毒基质蛋白的基因；

（S4）将步骤（S3）得到的所述基因重组至第二载体中，得到所述减毒病毒载体；

其中，所述编码第二载体的序列包含水疱性口炎病毒的基因组序列；

其中，所述第一载体选自具有转座功能的载体；

所述第一载体包含如SEQ ID NO:2所示的序列；

所述第二载体包含如GENBANK编号为EU849003.1所示的序列；

所述编码减毒病毒载体的序列包含如SEQ ID NO：4所示的序列。

2.一种减毒病毒载体，其通过权利要求1所述的制备方法得到。

3.一种克隆骨架载体系统，其特征在于，所述克隆骨架载体系统将如SEQ ID NO:5所示的序列重组至如权利要求2所述的载体中；其中，所述SEQ ID NO:5所示的序列插入编码如权利要求2所述的载体的位点为如SEQ ID NO：4所示的序列的第4632位。

4.根据权利要求3所述的克隆骨架载体系统，其特征在于，编码所述克隆骨架载体系统的序列包含如SEQ ID NO:6所示的序列。

5.一种制备减毒单克隆病毒株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（S1）培养第一待转染细胞；

（S2）将包含如SEQ ID NO:3所示的序列的质粒，和包含如SEQ ID NO:7所示的序列的质粒pN，包含如SEQ ID NO:8所示的序列的质粒pL，包含如SEQ ID NO:9所示的序列的质粒pP的质粒混合物，共转染至步骤（S1）中的待转染细胞中；

（S3）提取步骤（S2）共转染后得到的细胞混合液中的上清液，转染至第二待转染细胞中；

（S4）将步骤（S3）中被转染后的第二待转染细胞进行培养，筛选，得到减毒单克隆病毒株。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，包含如SEQ ID NO:3所示的序列的质粒，包含如SEQ ID NO:7所示的序列的质粒pN，包含如SEQ ID NO:8所示的序列的质粒pL和包含如SEQID NO:9所示的序列的质粒pP的重量比为10:4:1:5。

7.根据权利要求5-6任一项所述的方法，其中，所述包含如SEQ ID NO:3所示的序列的质粒为包含如SEQ ID NO:4所示的序列的质粒。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第二待转染细胞选自Vero细胞；所述第一待转染细胞选自BSR-T7细胞。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤（S2）中所述包含如SEQ ID NO:4所示的序列的质粒选自包含如SEQ ID NO:6所示的序列的质粒。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤（S2）中所述包含如SEQ ID NO:6所示的序列的质粒的编码序列进一步包含如SEQ ID NO:10所示的序列和如SEQ ID NO:11所示的序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，步骤（S2）中所述包含如SEQ ID NO:6所示的序列的质粒的编码序列进一步包含如SEQ ID NO:12所示的序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述包含如SEQ ID NO:12所示的序列的5’端还包含信号肽序列；所述信号肽序列选自如SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的序列。