[发明专利]一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用

说明书

本发明属于基因工程和酶制剂技术领域，具体涉及一种新型葡糖淀粉酶及其基因与应用。所述葡糖淀粉酶发酵液酶活可达90000‑120000U/mL，最适作用pH为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃，具有与乳酸单体生产菌种生长和产酸条件吻合的特征，可以在同步糖化同步产乳酸的过程中高效发挥催化作用。

技术领域：

本发明属于基因工程和酶制剂技术领域，具体涉及一种新型葡糖淀粉酶及其基因与在同步糖化发酵乳酸单体中的应用。

背景技术：

淀粉在液化酶的作用下，由高分子状态(淀粉颗粒)转变为较低分子状态(糊精)，变为流动性较好的淀粉液化液。α-淀粉酶是作为淀粉液化的主体酶，能于淀粉分子内部任意切开α-1,4糖苷键，而不能切开α-1,6糖苷键，也不能水解相邻分支点的α-1,4糖苷键。α-淀粉酶水解直链淀粉一般分两步进行，首先任意切开α-1,4糖苷键，使直链淀粉迅速水解成麦芽糖、麦芽三糖和较大分子量的麦芽寡糖，然后再将麦芽三糖和麦芽寡糖缓缓水解成麦芽糖和葡萄糖。上述形成的淀粉液化液经葡糖淀粉酶进一步水解形成葡萄糖用于葡萄糖的制备或其他产品的发酵生产。

工业生产用α-淀粉酶均不耐酸，当pH低于4.5时，活力基本消失，通常pH值为5.0-8.0之间较稳定，最适pH值为5.5-6.0。而目前商品化的葡糖淀粉酶的最适作用pH为4.5，因此需要在制糖过程中大量添加盐酸等pH调节剂。另外，上述制糖过程形成的葡萄糖浆直接用于发酵生产时，由于大宗微生物发酵pH主要集中在7.0左右，导致发酵过程需要再次添加碱性pH调节剂使得pH适宜微生物生长。在同步糖化同步发酵产品的工艺过程中这一矛盾更为明显。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明建立了一种最适作用pH接近中性，最适作用温度40℃左右的葡糖淀粉酶的高效制备方法，并形成了以淀粉液化液为原料同步糖化高效制备聚合级乳酸单体的技术。

本发明所要提供的技术方案之一，是一种新型葡糖淀粉酶，所述葡糖淀粉酶最适作用pH为6.5，最适作用温度为40-45℃，可用于同步糖化同步发酵工艺；

优选地，所述葡糖淀粉酶来自黑曲霉(Aspergillus niger)CICIM F0215菌株(保存于江南大学中国高校工业微生物资源与信息中心http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn)，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.20所示，其编码基因为glaF，核苷酸序列如序列表SEQID NO.21所示；

优选地，所述葡糖淀粉酶其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示，其编码基因为glaFs056，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示；

所述glaFs056编码的葡糖淀粉酶发酵液酶活可达90000-120000U/mL，最适作用pH为5.0～9.0，最适作用温度为30～50℃；优选最适作用pH为6.0～7.0，最适作用温度为40～45℃；更优选地最适作用pH为6.5，最适作用温度为40℃；

进一步地，上述葡糖淀粉酶基因的获得方式既可以是以来源微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，更可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成。

本发明提供的技术方案二，是表达上述葡糖淀粉酶的重组菌；

所述重组菌的表达宿主菌可以是米根霉、酿酒酵母、毕赤酵母、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、大肠杆菌等；

所述重组菌的表达宿主优选毕赤酵母GS115，表达载体优选质粒pPIC9K；

本发明提供的技术方案三，是上述新型葡糖淀粉酶的制备方法，具体如下：