[发明专利]一种马来酸异构酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种新型马来酸异构酶突变体，对应于如SEQ ID NO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L，A224G的突变。本发明发现新型马来酸异构酶以及其突变体相对于具有提高的酶活力和稳定性，突变体更为突出。此外，本发明还公开了马来酸异构酶或其突变体以任何形式与L‑天冬氨酸氨裂解酶组合应用于天冬氨酸的生产，包括二者耦合在一起的共表达的一菌双酶形式。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体而言，本发明涉及一种马来酸异构酶及其应用。

背景技术

L-天冬氨酸作为20种基本氨基酸的一种，广泛参与各种蛋白质合成中，是多种生物合成的前体。作为原料，L-天冬氨酸在食品、医药、化工等方面有广泛应用，下游产品包括丙氨酸、环保材料聚天冬氨酸、阿斯巴甜等。

传统生产L-天冬氨酸的方法为苯化学法开环裂解，化学催化法生成富马酸，再由L-天冬氨酸生产菌株全菌催化生成L-天冬氨酸。此步骤涉及2步化学催化以及一步发酵全菌体催化，路线长且不经济环保。

近年来，报道了由顺式丁烯二酸(马来酸)作为出发底物经过顺式丁烯二酸异构酶(马来酸异构酶，Maleate cis-trans Isomerase，MaiA，EC5.2.1.1)催化异构化生成富马酸，再经过天冬氨酸氨裂解酶催化合成天冬氨酸的全生物绿色转化方法(参见CN106755157A、CN107475320A)。然而，虽然这些生物绿色合成L-天冬氨酸的工艺取得了巨大进步，但具有成本相对较高、异构酶活力较低、稳定性差等缺点。因此，作为采用新工艺的全生物法仍处于工业化推广困境中。

要解决上述问题，最为关键的是提升异构酶表达活性以及稳定性、并进一步整合将生物酶法技术压缩至最低。目前有报道研究的异构酶有Serratia marcessens、Rhodococcus sp.RHA1、Alcaligenes faecalis IFO13111、B.stearothermo.philus MI102等物种来源的马来酸异构酶。但是，这些异构酶仍存在酶活力较低、稳定性较差、在工业生产方面易受成本限制等缺陷。

因此，本领域仍然存在对新型的马来酸异构酶及其使用方式的需要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种新型的马来酸异构酶，其相对于目前已知的马来酸异构酶，具有提高的酶活力与稳定性，且在转化马来酸生产L-天冬氨酸时，具有更好的底物转化效果以及更为灵活、简单的使用方式。

本发明提供以下技术方案。

一方面，本发明提供一种马来酸异构酶突变体，对应于如SEQ ID NO.1所示的马来酸异构酶的氨基酸序列，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列具有F39L和/或A224G的突变。

SEQ ID NO.1示出了NCBI序列ID：WP_010929891.1的马来酸异构酶的氨基酸序列。按照该大类的马来酸异构酶的三维结构特点以及采用酶工程随机突变技术，在一个或多个位点进行突变后得到一系列突变体，再经过稳定性、酶活性等筛选，得到本发明提供的马来酸异构酶突变体。具体地，相对于该已知马来酸异构酶(亲本)，本发明提供的马来酸异构酶突变体为两点突变酶(F39L，A224G)的突变。

优选地，本发明的马来酸异构酶突变体包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；更优选地，所述马来酸异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

另一方面，本发明提供编码所述马来酸异构酶突变体的基因序列；

优选地，所述基因序列包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；

更优选地，所述基因序列包含如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

还一方面，本发明提供包含所述基因序列的载体；