[发明专利]人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备及其检测方法

权利要求书

1.人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、制备人参黑斑菌真菌培养物；

B、对培养物破碎并进行DNA提取；

C、人参黑斑菌16S rRNA扩增；

D、胶体金的制备；

E、胶体金颗粒与链酶亲和素的结合；

F、核酸传感器的制备与组装。

2.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，所述的DNA提取方法为磁珠法或者CTAB法；优选的，所述的DNA提取方法为磁珠法。

3.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的人参黑斑菌16S rRNA扩增：根据李烨报道的人参黑斑菌特异引物进行人参黑斑菌DNA的扩增，引物序列如下，5’-CCTGCGGAGGGATCATTACACA-3’；5’-ACGCTGACCTTGGCTGGAAGA-3’，扩增目的条带大约为475bp，引物由上海生物工程有限公司合成；PCR反应体系为15μL的PCR Mix，1μL的基因组DNA，各引物均1μL 10μM，加入双蒸馏水定容到系统总体积25μL；PCR的扩增条件为：95℃预变性2min，95℃变性1min55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，4℃保存；将5μL PCR产物通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。

4.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的胶体金的制备方法，包括以下步骤：称取100mL双蒸水于平底烧瓶中，在电炉上加热至沸腾；加入1.0mL 1％HAuCl₄溶液，继续加热，加入1.25mL 2％的柠檬酸三钠，继续煮沸；溶液将依次由浅黄色变为灰色、黑色、紫色，最后为酒红色，继续搅拌，5min后取出烧杯；待胶体金冷却至室温时，补充至原先的体积；将瓶身用铝箔纸包裹，4℃避光保存即可。

5.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的胶体金颗粒与链酶亲和素的结合，包括以下步骤：

a、取10mL胶体金，调pH至7.0，在搅拌状态下，加入SA至最佳标记量，在室温下反应30min；加入100μL 10％BSA，继续搅拌10min；加入200μL 10％(W/V)BSA进行封闭，缓慢颠倒混匀10min；

b、再加入200μL 10％(W/V)PEG进行二次封闭，缓慢颠倒混匀10min；

c、随后，9000rpm 4℃离心30min，弃上清，得到胶体金-SA结合物，用5mL金标稀释液复溶，铺在玻璃纤维上，37℃烘干过夜，密封干燥保存，即可得到胶体金颗粒-链霉亲和素复合物。

6.如权利要求5所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的金标稀释液，由以下成分组成：硼砂,硼酸,0.5％Casein,2.5％蔗糖,0.1％PEG,0.1％TritonX-100和0.05％NaN₃。

7.如权利要求1所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的核酸传感器的制备与组装，包括以下步骤:将胶体金颗粒-链霉亲和素复合物铺于金标结合垫；将鼠抗Fam单克隆抗体和BSA-生物素铺于硝酸纤维素滤膜的T线和C线；取底板作为支撑，底端粘贴样品垫，顶端粘贴吸水垫，中间粘贴硝酸纤维素滤膜，组装完成，试纸条切刀裁剪成合适尺寸，装入含有干燥剂的铝箔袋中密封保存，标明制备日期、名称，即可。

8.如权利要求7所述的人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的制备方法，其特征在于，所述的核酸传感器，由底板、硝酸纤维素膜、金标结合垫、样品垫和吸水纸五部分组成。

9.人参黑斑菌-单管巢式PCR-核酸传感器的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：通过外引物F1和R1对靶DNA进行PCR扩增；随后在同一反应管中内引物F2和R2以一扩的PCR产物为模板进行巢式PCR扩增；其中，F2在序列的5'端用Fam标记；

步骤二：PCR扩增结束后，PCR扩增子经高温变性，变性的Fam标记的单链DNA与Biotin修饰的特异性核酸探针在46℃下杂交，形成被Fam和Biotin标记的三明治样夹心复合物；

步骤三：将5μL杂交物上样于核酸传感器的样品垫；随后，将核酸传感器下部吸水垫浸入95μL的展开液中；在展开液作用下，复合物中的Biotin位点与金标结合垫中链霉亲和素-胶体金复合物结合，形成新复合物，并在展开液作用下自下而上层析，当到达T线时被包被的鼠抗-Fam单克隆抗体捕获，反应过程中由于胶体金颗粒在检测线的大量富集，形生可见的红色条带；过剩的胶体金-链霉亲和素继续层析至C线，被C线的Biotin捕获，C线可形成可见的红色条带，此时，检测结果呈阳性；若仅C线显红色，则结果呈阴性；若T线和C线均无色，表明核酸传感器已经失效。