[发明专利]一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用

说明书

本发明公开了一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，属于基因工程技术领域。该异戊二烯合酶基因IspS_ib的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，异戊二烯合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还提供了一种含有所述异戊二烯合酶基因的原核表达载体以及由该原核表达载体以及甲羟戊酸途径下游表达载体共转化获得产异戊二烯工程菌，本发明还提供了一种发酵生产异戊二烯的方法以及上述异戊二烯合酶基因、异戊二烯合酶、具有异戊二烯合酶活性的酶、其原核表达载体及其工程菌在生产异戊二烯中的应用。本发明所提供的异戊二烯合酶酶活性较高且对底物DMAPP的亲和力高。

技术领域

本发明涉及一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来 源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法（包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法）和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。

生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。目前，将大肠杆菌中的MEP途径过表达，或者直接导入外源MVA途径，同时导入植物来源的异戊二烯合酶，通过发酵可以实现异戊二烯的生物合成。但是，目前所构建的异戊二烯工程菌其产量和产率都没有达到工业生产的需求。

在异戊二烯代谢途径中，异戊二烯合酶是一个非常重要的限制性酶。在异戊二烯工程菌中DMAPP过量累积，另外在体外酶反应体系中，异戊二烯合酶的加入量是MVA途径另外一个限制酶异戊烯焦磷酸异构酶（isopentenyl pyrophosphate isomerase，IDI）的8倍，是其他酶的16倍，另外目前所研究报道的异戊二烯合酶其活性都比较低，对底物DMAPP的亲和力都比较低，这些都证明了异戊二烯在代谢途径中是一个非常重要的关键酶。目前，来自于白杨（Populus alba）和葛根（Pueraria montana）的异戊二烯合酶常应用于异戊二烯的生物合成。另外，利用来自于毛果杨（Populus trichocarpa）和蓝桉（Eucalyptus globulus）的异戊二烯合酶也有报道，而且其异戊二烯产量相对有所提高。但是，目前文献报道的这些异戊二烯合酶在代谢途径中都严重阻滞代谢流，离实现工业化生产距离还较远，寻找新物种来源的异戊二烯合酶是非常必要的。因此，对不同物种来源的异戊二烯合酶进行筛选分析，对其活性进行检测，构建异戊二烯工程菌，对比其异戊二烯产量，最终筛选得到异戊二烯产量高的异戊二烯合酶，这对于最终在工业上实现异戊二烯的生物合成是至关重要的。

发明内容

为解决现有异戊二烯合酶的活性较低且对底物DMAPP的亲和力较低以及它们在代谢途径中都严重阻滞代谢流的问题，本发明提供了一种异戊二烯合酶和其编码基因、表达载体、工程菌以及生产异戊二烯的方法及应用，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种编码异戊二烯合酶的异戊二烯合酶基因IspS_ib，该异戊二烯合酶基因IspS_ib的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述异戊二烯合酶基因IspS_ib来源于甘薯（Ipomoea batatas）。