[发明专利]家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子及其重组载体和应用

说明书

本发明涉及家蚕核型多角体病毒诱导型39K启动子及其重组载体和应用，该启动子是以BmNPV延迟早期基因39K的启动子最优序列作为“母体”启动子，逐步截短分析降低启动子长度，构建重组启动子，仍具有很强的BmNPV诱导启动活性，并验证家蚕核型多角体病毒立即早期基因IE‑1蛋白可以转录结合39K(‑310～‑355)区域诱导39K启动子表达，我们利用该区域构建了不同的人工合成诱导型启动子，能够高效提高39K及其他不同启动子诱导表达活性，该人工合成诱导型启动子不但适用于基因功能分析等分子生物学理论研究和家蚕核型多角体病毒表达系统应用研究，同时适用于利用基因工程技术进行的家蚕品种改良。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及家蚕核型多角体病毒诱导型39k启动子，还涉及含有该启动子的重组载体和应用。

背景技术

家蚕是具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫。蚕丝业为世界经济、文化和社会发展做出了重要贡献。家蚕和家蚕核型多角体病毒作为高效表达外源蛋白的生物反应器，在生物工程领域具有重要的应用价值。天然启动子的低表达活性和非特异性在生物工程的应用中存在一定的局限性。在前期研究工作中，发明人所在课题组发明了BmNPV 39K诱导型启动子(ZL201010231957.9)以及改造后的增强型En39K(ZL201310641709.5)。该启动子具有BmNPV诱导启动活性，能使细胞在受到BmNPV感染时启动外源基因的表达，但其启动子长度太长，核心调控区域未知，已不能满足现实需要。迫切需要在家蚕(鳞翅目)中构建高效的人工合成诱导型启动子满足不同生物工程需求。

诱导型启动子是诱导型调控序列或诱导型增强子，是一组能在特定物理、化学或病原体信号刺激下增强外源基因表达的启动子。一般而言，诱导型启动子与转录激活子一样，以非活性形式存在，并可通过相应的信号刺激直接或间接激活。目前，诱导型启动子(Cre/LoxP、Tet-ON/Tet-OFF、蜕皮激素和病原体诱导系统)的几种技术方法被广泛应用于动植物基因工程领域，包括基因功能鉴定或品种改良。昆虫是地球上最大的生物类群。很多经济昆虫(如蚕和蜜蜂)具有非常重要的经济价值。然而，在昆虫基因工程研究中还没有一个较好的诱导系统，因此在抗病育种和基因治疗中构建致病诱导型启动子具有重要意义。

人工合成的启动子是通过结合不同启动子元件的不同组合来构建更强的表达水平，并用启动子的不同组合替换或重新设计序列。植物中的合成启动子的研究相对较多，大多集中在合成诱导型合成启动子上。合成启动子主要是利用顺式调控元件来融合核心启动子。构建不同病原诱导型人工启动子可有效提高转基因抗病基因在植物抗病育种中的广谱性。或者，构建与组织特异性启动子(根、茎、叶等)和诱导型启动子结合的人工诱导启动子有助于特定组织诱导表达，以提高作物品质和提高作物抗性和抗病性。人工合成的启动子也被报道在动物，其构建方法主要是通过不同表达调控序列的同向组装，应用于靶向治疗疾病，以及外源基因的特异性组织表达。人工合成启动子在昆虫研究中才刚刚起步，特别是在昆虫疾病育种领域。

在以前的研究中，筛选了BmNPV诱导启动子(VP1054、P33、BM21、BM122、39K、p143和p6.9)活性，发现39K启动子具有最高的BmNPV诱导的转录活性(ZL201010231957.9)。并使用HR3、H5、POLH和PU的增强子进一步增强BmNPV 39K启动子的病毒诱导活性。可诱导的39K启动子控制的外源Hycu-ep32基因的过度表达在转基因品系中具有高的抗病毒能力。此外，我们构建了一个家蚕核型多角体病毒诱导的RNA干扰系统，它可以抑制BMNPV复制，受到病毒感染的严格控制，并且对宿主细胞没有毒性。并且高效的利用病毒诱导的39K启动子CRISPR/Cas9基因编辑系统，降低了潜在的靶效和高的编辑效率，增强了家蚕细胞的抗病毒能力。因此，为了使病毒诱导的39K启动子在基因功能研究、家蚕抗性育种和害虫防治中更有效，人工合成诱导型启动子在昆虫中是非常迫切的。

发明内容