[发明专利]一种酶法制备奥利司他中间体的方法

说明书

本发明涉及医药技术领域，公开了一种酶法制备奥利司他中间体的方法，包括短链醇脱氢酶原始基因的合成、短链醇脱氢酶的表达、细胞破碎及酶催化等步骤，利用短链醇脱氢酶催化法制备高手性ee值(ee＞99%)的奥利司他中间体（R）‑3‑羟基‑十四烷酸甲酯，以替代传统的化学合成方法，减少生产成本及对环境的污染。本发明提供的奥利司他中间体的合成方法，反应条件更温和，反应速度更快，反应收率和手性ee值高，且生产成本低，适合工业扩大化生产。

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种酶法制备奥利司他中间体的方法。

背景技术

奥利司他，是目前全球唯一的OTC减肥药。奥利司他是长效和强效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，它通过与胃和小肠腔内胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性丝氨酸部位形成共价键使酶失活而发挥治疗作用，失活的酶不能将食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解为可吸收的游离脂肪酸和单酰基甘油。未消化的甘油三酯不能被身体吸收，从而减少热量摄入，控制体重。该药无需通过全身吸收发挥药效。

奥利司他的结构式：

通过对奥利司他的结构分析可知，(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成奥利司他的重要原料。因此，开发有效制备光学纯的(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法具有重要的应用前景。

(R)-β-羟基十四烷酸酯生物催化的反应路线为：

R＝CH₃或C₂H₅

目前，(R)-3-羟基-十四烷酸甲酯的合成主要以化学合成为主，但该方法需要使用价格昂贵的手性配体和金属试剂，产品收率低，手性ee值不高，同时化学生产成本大且对环境不优化，不适于规模化生产。中国专利公开号CN101538285，公开日2009年9月23日，发明专利的名称为钌-手性双膦配体络合物及制备方法以及在β-羰基十四烷酸甲酯的催化氢化反应中的应用，该专利公开了一种钌-手性双膦配体络合催化剂以及其制备方法。利用该催化剂制备(R)-3-羟基-十四烷酸甲酯的手性ee值小于99％，催化剂成本较高，且催化反应需在强酸、高压条件下进行，对生产设备要求高且具有很大的腐蚀性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酶法制备奥利司他中间体的方法。本发明利用短链醇脱氢酶催化法制备高手性ee值(ee＞99％)的奥利司他中间体(R)-3-羟基-十四烷酸甲酯，减少生产成本及对环境的污染。

本发明的具体技术方案为：一种酶法制备奥利司他中间体的方法，包括以下步骤：

(1)短链醇脱氢酶原始基因的合成：按照大肠杆菌密码子分析用表对短链醇脱氢酶NA-ADH原始基因序列进行密码子优化，得到优化后的NA-ADH基因序列，对其进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-NA-ADH，优化后的NA-ADH基因序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)短链醇脱氢酶的表达：将重组表达载体pET26b-NA-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，挑取单菌落，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，然后添加IPTG，诱导培养过夜；

(3)细胞破碎：将培养好的菌株离心，收集菌体，重悬菌体后对其进行超声破碎，所得液体即为含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液；

(4)酶催化：将β-羰基十四烷酸甲酯加入反应器中，随后，将NAD⁺、含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、葡萄糖、磷酸盐缓冲液的混合溶液加入反应器中，进行反应。