[发明专利]用于筛选冬瓜实时荧光定量PCR内参基因UBQ的引物

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于筛选冬瓜实时荧光定量PCR内参基因UBQ的引物。本发明利用所述特异引物，筛选出泛素基因(Polyubiquitin,UBQ)在冬瓜高温胁迫和干旱胁迫下均能稳定表达，适合在冬瓜基因表达研究中作为内参基因。本发明首次将泛素基因(Polyubiquitin,UBQ)作为内参基因用于冬瓜基因表达分析，有利于提高冬瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；本发明提出的检测引物具有特异性，大大的提高了检测效率，提高了检测结果的可信度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于筛选冬瓜高温胁迫和干旱胁迫条件下实时荧光定量PCR内参基因的引物。

背景技术

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）属葫芦科冬瓜属一年生蔓性草本植物。冬瓜的花、叶、果皮、果肉、种子具有很好的药食兼用价值，可用于治疗咳嗽、哮喘等疾病。同时，瓜中富含氨基酸、维生素C、酚类等活性化合物，这些化合物在预防慢性疾病方面具有一定作用，并且冬瓜是瓜菜中唯一不含脂肪的瓜菜，富含丙醇二酸成分，能抑制糖类物质转化为脂肪成分。随着研究的深入，利用分子生物学技术了解冬瓜功能成分和调控机理相关基因表达成为重要的研究方向。

目前关于冬瓜不同部位和低温胁迫条件下的内参基因的研究还未见报道。本发明以分别以 “黑皮冬瓜”真叶为材料，进行两组不同的处理。第一组：42℃处理0、1、6、12、24h；第3组为26℃，光照16h，干旱处理1、2、3、4d。每个处理3次生物学重复。采样后液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存使用。利用GeNorm、 NormFinder和 BestKeeper对7个候选内参基因的表达稳定性分析评价，筛选出泛素基因 (Polyubiquitin, UBQ)作为合适的内参基因，为冬瓜后续相关基因表达研究提供参考。

发明内容

本发明的目的在于提供用于筛选冬瓜不同组织实时荧光定量PCR内参基因UBQ的引物，本发明中的1对内参基因引物序列特异性扩增高，扩增效率接近，线性相关性好，可用于筛选冬瓜高温胁迫和干旱胁迫稳定的内参基因。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

以冬瓜DNA为模板、以冬瓜转录组测序为基础，利用Primer Premier5.0 软件、并遵循实时荧光定量PCR引物设计的原则设计出7对荧光定量特异引物，最终根据数据分析，确定该对荧光定量特异引物即为所述实时荧光定量PCR引物；

且该实时荧光定量PCR引物为：

正向引物5'- GTGAATTATAGAATCGAGCATC -3'，

反向引物5'- AAATCAGAAACAATCCCAAC -3'。

本发明的有益效果在于：

本发明提供用于筛选冬瓜实时荧光定量PCR内参基因的引物， 所设计的实时荧光定量PCR引物用于冬瓜基因表达分析时，能够提高中冬瓜基因表达分析研究的稳定性、可靠性和重复性；此外，所设计的实时荧光定量PCR引物特异性强，从而能够大大的提高了采用实时荧光定量检测冬瓜的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

附图说明

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。

图1 是本发明中冬瓜7个候选内参基因扩增结果。

图2A 28s候选内参基因 qRT-PCR 融解曲线。

图2B EF-1α候选内参基因 qRT-PCR 融解曲线。

图2C GAPDH候选内参基因 qRT-PCR 融解曲线。

图2D RP II候选内参基因 qRT-PCR 融解曲线。