[发明专利]一种蛋白质及多肽保护剂及其应用

说明书

本发明公开了一种蛋白质及多肽保护剂及其应用。该保护剂属于一种多肽，其氨基酸序列为(‑Arg‑Gly‑)_X，简写为(RG)x。其中，X＝2,3,4,5或6。可采用固相合成法制备。本发明的目的在于：为基因工程及生物制药领域提供一种发酵过程中的目标蛋白质(或多肽)保护剂。其作用在于：能够抑制含有‑Arg‑Gly‑氨基酸序列或于Arg位点处易被蛋白酶水解的重组蛋白质或多肽的水解，促使目标产物的成功表达，并提高其表达量，降低有关杂质含量。还能够降低纯化难度，提高目标产物的制备收率。有助于多种重组蛋白质或多肽类产品实现高效率的工业化生产。

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种蛋白质及多肽保护剂。用于以基因重组技术进行蛋白质或多肽类产品制备时，发酵过程中目标产物的保护。添加该保护剂后，能够抑制目标产物的降解，维持其在生产工艺过程中的稳定性。有助于实现难以在微生物(如酵母菌、大肠杆菌)或动物细胞、昆虫细胞中表达的蛋白质及多肽的制备，并有助于提高其产率，降低目标产物的纯化难度。

背景技术

自十九世纪八十年代，第一个基因工程产品重组人胰岛素问世后，至今已有200余个基因工程药物投放市场。主要包括：干扰素、生长激素、凝血因子、白细胞介素、表皮生长因子、集落素刺激因子、神经生长因子、胰岛素类似物与胰高血糖素样肽-1类似物等。全球人用重组蛋白药物的市场规模已超过1600亿美元，未来的5至10年间，还将有更多的通过DNA重组技术生产的新药进入市场。在我国，生物制品用药总体规模也已超1300亿元，在国内药品市场中占比接近10％。

这些重组蛋白质及多肽类药物的表达与制备，多是利用微生物或者哺乳动物细胞、昆虫细胞等宿主进行。其中，被使用最多的微生物是酵母工程菌与大肠杆菌工程菌。以微生物为宿主，利用重组DNA技术表达目的蛋白的通用方法为：通过基因工程操作，将获取的编码目标产物的外源基因与质粒载体进行体外重组，再将重组后的携带外源基因的质粒转化入宿主菌，或者将质粒线性化后通过同源重组把外源基因整合入宿主菌的染色体，形成稳定的转化子。载有外源基因的工程菌通过发酵扩增以及诱导表达后，得到大量目的蛋白质或多肽。再通过后续的粗提、纯化及制剂等操作，最终获得高纯度的药物制剂。

若要实现利用微生物高效表达真核基因，必需攻克强三个核心难题：①.蛋白产物的生物合成；②.抑制蛋白产物的降解；③.维持或恢复蛋白质的特异性空间构象。其中，在抑制蛋白产物降解方面，外源基因表达产物的稳定性普遍较差，在发酵过程中易被宿主的特异性蛋白酶降解，造成表达量偏低甚至表达失败。例如，丝氨酸蛋白酶会特异性地水解谷氨酸和门冬氨酸残基羧基侧的肽键，对蛋白质造成破坏，并且在pH值4.0～10.0的范围内均具有酶活。而当在某些蛋白酶的作用下，特异性的水解发生在肽链末端的1～2个氨基酸位点时，还会造成与目标物结构高度近似的杂质出现，大幅增加后期的纯化难度，进而造成纯化收率的下降，甚至会高纯度目标物的不可及。这也限制了很多重组产品工业化的实施，尤其是分子量5000Da以下的多肽类产品。

当前，抑制重组蛋白及多肽于发酵过程中降解的方法主要有三种。

第一种方法是开发蛋白酶缺陷的工程菌株。例如，在酵母体系中液泡蛋白酶PrA和PrB分别由基因PEP4和PRB1编码，其对于几个液泡蛋白酶成熟和活化是必需的，因此△PEP4-△PRB-1双突变酵母表现为蛋白酶缺陷。对酿酒酵母、毕赤酵母或C.boidinii酵母的液泡蛋白酶基因PEP4和PRB1以及其它蛋白酶基因，如CPY1、YPS1、KEX2进行敲除可减少外源蛋白质的降解。但若仅敲除个别蛋白酶，多数情况下，对外源蛋白降解的控制有限。因此，系统地考察、筛选宿主微生物的蛋白酶系并对多个蛋白酶进行修改或敲除，才有可能显著降低外源蛋白质的水解程度。例如，文献报道，有研究者构建了8个蛋白酶基因同时被删除的缺陷型菌株A8，使该菌株分泌HGH的量增加了近30倍。